[方法]
1．设计合成含有CDR3随机化序列的VLFOR引物。当然，此引物必须以拟进行亲和力成熟的抗体VL基因作为基础进行设计。本例中，VLCDR3的7个氨基酸被随机化。在每个随机化位点中，保留了大约50％野生型氨基酸。引物设计结果如下：
VLFOR随机引物： 5’—CCC TCC GCC GAA CAC CCA ACC 524 513 524 524 542 541 511 CTG GCA GTA ATA ATC AGC CTC—3’
数字对应摩尔分数如下。
（1）A（70％）、C（10％）、G（10％）、T（10％）。
（2）A（10％）、C（70％）、G（10％）、T（10％）。
（3）A（10％）、C（10％）、G（70％）、T（10％）。
（4）A（10％）、C（10％）、G（10％）、T（70％）。
（5）G（50％）、C（50％）。
利用分子建模去识别哪个CDR3残基具有溶剂可接近侧链，来确定随机化残基。
2．配制4个50w1 PCR反应混合液，包含：
● 去离子水，35．5ul
● 20XdNTP， 2．5ul
● 10XVent聚合酶缓冲液，5．0ul
● lMB3引物（10pmol/ul），2．5ul
● VI-FOR引物 （10pmol/ul）， 2．5ul
● 野生型scFv基因模板DNA（100ng）， 1．0ul
● VentDNA聚合酶（2单位），1．0ul
3．在有加热盖的热循环仪内加热混合液到94℃，5分钟。
4．以94℃1分钟、42℃1分钟、72℃2分钟的条件共循环30次，扩增VL基因。
5．在1％琼脂糖胶上胶纯化VL基因（接近800bp）；用Geneclean试剂盒提取DNA。将
每种产物重悬于20ul水中。在1％琼脂糖凝胶上与已知大小和浓度的标准对照品比较，测定DNA浓度。