从天然V基因中制备噬菌体抗体文库时，有多种不同B细胞（即V基因）来源可供选择。一般而言，可在两种V基因之间做出选择：一种是未经历体细胞突变的V基因[天然的且一般是免疫球蛋白M（1gM）]，一种是发生过此突变的V基因[免疫的且一般是免疫球蛋白G（IgG）]。自IgM演变为IgG过程中，存在着一个天然度的梯度变化。采用多样性小于10‘天然文库所做的早期试验结果提示：IgM来源的V基因优于IgG来源的V基因。然而，用来自骨髓、外周血以及扁桃腺的未分部V基因组建了一个容量大很多的抗体文库，从中分离到了针对许多抗原的抗体。对来自此文库V基因进行的分析显示：大多数所选择到的结合抗原的V基因含有多个突变体；这提示它们或来自IgG，或来自突变的IgM区。其他大容量天然文库无一例外地使用IgM来源的V基因。

来源于外周血、脾脏、扁桃腺和骨髓的淋巴细胞都可用来构建文库。对它们的优劣势还没有系统性地研究，尽管可以预期来自慢性感染的组织（扁桃腺）所含V基因可能高度偏向于感染性致病原。无论采用何种来源的淋巴细胞，流程基本上都是一致的。

无需制备多聚腺苷酸RNA（poly A RNA）来合成cDNA，总RNA效果就已很好。构建免疫文库应使用以IgG为基础的引物，而天然文库的制备采用IgM引物。另外有一种方法是，先用随机六聚体引物引导RNA，接着再用特异性3’端引物分离IgM或IgG特异性V基因。

cDNA合成后，用特异性引物可从cDNA中扩增V区；这些引物可以识别重排V基因5’端和3’端相对保守的元件。