DNA

dNTPDAN聚合酶乙醇TE限制性内切核酸酶缓冲液

水浴锅培养箱

1.  将两种寡核苷酸各1 μg加入微量离心管中，加水至17 μl，再加2 μl 的10×测序酶缓冲液。70℃加热5 min，然后在合适的退火温度下保温5  min，取2 μl 留待以后的分析。

2.  加2 μl 4种dNTP混合液和10 U测序酶，30℃温育30 min。

3.  70℃ 10 min 灭活DNA聚合酶，取2 μl 留待以后的分析。

4.  加10×限制性内切酶反应缓冲液，加水和20~100 U 的适合于克隆的限制性内切酶至100 μl。适当的温度下消化2 h 以上。

5.  酚抽提，加100 μl 4 mol/l 乙酸铵和400 μl 的无水乙醇，-70℃沉淀15 min，离心5 min，沉淀重悬于100 μl TE缓冲液，用乙醇再沉淀一次，用95%乙醇洗涤沉淀，干燥，20 μl TE缓冲液溶解，取2 μl 用于以后的分析。

6.  用筛分型琼脂糖凝胶电泳分析确证原材料、延伸产物和酶切产物，估计延伸的寡核苷酸的量，再用适当的载体亚克隆。

7.  对几个合适的亚克隆测序。