从酵母中小规模自然亲和纯化溶解膜蛋白

一、材料与方法

1.  EDTA（无蛋白酶抑制剂）（Roche）

2.  酸冲洗过的425-600玻璃珠（Sigma）

3.  洋地黄皂苷（digitonin）（EMDChemicals）

4.  蛋白酶抑制剂（DMSO,亮肽素,抑制剂）（Sigma）

5.  BECKMAN1.5 ml 离心管（BECKMAN）

6.  抗FlagM2亲和胶（Sigma）

7.  3XFLAG多肽（Sigma）

二、仪器设备

1.  BECKMAN离心机、TLA-55转子

三、实验步骤

1.  细胞裂解

（1）酵母摇至25OD，集菌。4℃，用1 ml H₂O或PBS缓冲液洗涤细胞。若需要，可在-80℃保存样品。

（2）用150 ul 预冷好的免疫沉淀缓冲液重悬细胞，缓冲液（无DTT）中加入0.1%digitonin和蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂。加入玻璃珠没于液面下。在冷藏室，涡旋振荡10分钟。Digitonin是强刺激性非离子去污剂，可以完整提取膜蛋白。

（3）加入850 ul 免疫沉淀缓冲液（包含1.16%Digitonin和蛋白酶抑制剂，无DTT），定容至1 ml。此时Digitonin终浓度为1%。4℃，翻转摇床孵育30分钟，此过程中膜蛋白可溶于缓冲液中。转移液体至新的BECKMAN离心管中。

（4）100 000 g 离心10分钟，去除为裂解的细胞、细胞核、细胞膜。膜蛋白已从膜上分离，溶于上清中。离心（用TLA-55转子，47 246 rpm），吸取上清。保存80 μl 上清，作为input对照。

2.  带有FLAG标签的蛋白的免疫沉淀反应

（1）每个反应使用50 μl 胶悬浮液。（~25 μl 填充胶）。若使用亲和柱则使用量更小（~10 μl 填充胶，可以结合>1 μg FLAG-标签蛋白）。

（2）悬起抗-FLAGM2亲和柱。悬浮液与填充胶的比例应为2：1。转移50 μl 悬浮缓冲液及亲和柱至新的试管中。转移应使用移液管，并剪去其尖头。

（3）400 g 离心1分钟。静置1~2分钟。用移液管去除上清。

（4）用1 ml 含有0.1%digitonin的免疫沉淀缓冲液漂洗吸附柱，重复4次。洗涤过程中尽量保证漂洗液去除干净，并且没有丢失吸附柱。这是为了确保在蛋白结合柱子前，甘油已经*去除。如果免疫沉淀样品较多，可以同时漂洗吸附柱。在漂洗后，根据样品数量分配吸附柱。每次漂洗，应使用大于吸附柱体积20倍的漂洗液。（如25 μ l吸附柱，>500 μl 漂洗液）

（5）向漂洗过的吸附柱中加入800 μl 细胞裂解产物。可以用免疫沉淀缓冲液将总体积定容至1 ml。细胞裂解产物的体积取决于细胞中表达的带有FLAG标签的蛋白的量。加入1 ml 裂解缓冲液作为负对照。

（6）搅动样品，在翻转摇床上轻柔孵育2.5小时。

（7）400× g 离心1分钟。用移液管去除上清。保存80 μl 上清作为未结合对照。

（8）用1 ml 免疫沉淀缓冲液漂洗吸附柱，重复4次。

3.  洗脱带有FLAG标签的蛋白

用3×FLAG多肽洗脱。此方法洗脱效率*

（1）准备3×FLAG洗脱缓冲液。加入30 μl 漂洗缓冲液（含0.25%digitonin和2 μg/μl 3×FLAG多肽）

（2）向有吸附柱的试管中加入30 μl 3×FLAG洗脱缓冲液。

（3）4℃，摇床轻柔孵育30分钟。

（4）400~1 000× g 离心1分钟。将上清转移至新试管中。注意不要吸入吸附柱