士锋DNA末端修饰原理

Chapter 4 replication
DNA replication
DNA damage and repair
Reverse transcription
RNA replication
DNA复制的基本特点
半保留复制(self-conservative replication)
复制子(replicon)
半保留复制
1958年,Meselson 和Stahl用实验证实了DNA的半保留复制.
步骤:
用普通培养基(14N)培养15N标记的大肠杆菌.用CsCl密度梯度离心法分析DNA.
加热子一代DNA分子.
复制子(replicon)
复制子:基因组中能单独进行复制的单位.
每个起始点到终止点的区域为一个复制子.
起始点(origin of replication ,ori):原核生物DNA分子中只有一个,长度 200bp左右.大肠杆菌ori C有245 bp.真核生物有多个复制起始点.
终点(ter):D,A,C,B(23bp共有序列)Tus(terminator utilization substance)识别终止序列.
复制的方向:单向或双向 
原核生物DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)
1958年Kornberg首先从大肠杆菌提取
DNA polⅠ:聚合作用:5` → 3`
3` → 5`外切酶活性:校对功能
5` → 3`外切酶活性:引物切除,损伤修复
主要功能是切除引物,填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复
DNA polⅠ是单一肽链的大分子,分子量为109kD,二级结构以α-螺旋为主.
用特异的蛋白酶处理,可把DNA polⅠ水解为两个片段,即在F,G螺旋之间发生断裂.
小片段:323个氨基酸残基, 5` → 3`外切酶活性
大片段或称Klenow片段:604个氨基酸残基,DNA聚合酶活性和3` → 5`外切酶活性
DNA pol Ⅱ:5` → 3`聚合酶活性及3` → 5`外切核酸酶活性.
DNA polⅢ: 由10 个亚基组成,分别为α,ε,θ,τ,δ,δ`,β,κ及ψ.是原核生物体内真正起复制作用的酶.
α亚基: 5` → 3`聚合酶活性
ε亚基:3` → 5`外切酶,校对和编辑
θ为装配必须
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ
真核生物DNA聚合酶
α,β,γ及δ四种,都有5`→ 3`聚合功能.α及δ参与核DNA复制;
α:链合成的引发,δ:链的延长
polδ;切除引物后填补空隙
β:外切核酸酶 
γ:线粒体DNA复制
其它环状DNA分子的复制
1,θ复制:首先由J.Carins 从大肠杆菌中观察到,又称为 Carins复制.
2,滚环复制(rolling circle replication)
3,D环复制(D loop replication):线粒体DNA复制
端粒与端粒酶(omerase)
omere:真核生物线性染色体3末端的一种特殊结构.核苷酸重复序列富含G,和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物.人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列,长度5~15kb.
作用:保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解;解决染色体复制时末端丢失问题.

omerase: 由RNA和蛋白质组成的酶.兼有模板和逆转录酶两方面的作用.
1995年,Junli Feng等克隆了人类端粒酶RNA基因,长约450个碱基的RNA序列中有一段长11个核苷酸的区域(5-CUAACCCUAAC-3)与人的端粒序列(TTAGGG)n互补.
端粒酶蛋白质的分离:四膜虫端粒酶两个多肽成分p80和p95.
端粒与衰老
实验:在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时,端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制.
结论:细胞的衰老是由端粒驱动的.
体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短,丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用.细胞随之发生衰老和死亡.
可把端粒看成一面钟,端粒的长度是钟上的刻度,记载了细胞分裂的次数,称为"端粒钟",或有丝分裂钟 或"生命的时钟",可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命.
胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短,具有无限的分裂能力,原因在于端粒酶的存在.