兔肝RNA的制备及测定

实验目的：
学习从兔肝中提取RNA的方法。
通过地衣酚显色法测定RNA的含量。

实验原理：
细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。由于RNA的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，盐酸胍法，去污剂法和法。其中，以法使用较为广泛。产品纯度高，适合小规模生产。
动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富。经组织匀浆用处理并离心后RNA溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层中加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA；其工艺简单，所提取的核酸均为变性RNA，只能用作制备核苷酸原料。本实验就是将兔肝组织，在酚与十二烷基硫酸钠的存在下，RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固。RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀，达到分离。
RNA含量的测定，除了可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定，其反应原理是当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯（地衣酚orcinol)反应，在Fe3+或Cu２+催化下，生成鲜绿色的复合物．反应产物在670nm处有zui大吸收。RNA在20－250微克范围内，光吸收与RNA浓度 成正比。地衣酚反应特异性较差，凡是戊糖均有此反应。DNA和其他杂质也能给出类似的颜色。

实验试剂
0.05mol/L醋酸缓冲液（PH5.0）
0.05mol/L醋酸钠35毫升， 0.2mol/L醋酸15毫升，加蒸馏水至1000毫升，混合后测PH5.0
25%SDS:称取SDS25克，溶于50％乙醇中至100毫升，室温存放。
80％酚：取80份，加蒸馏水20份，混匀后装棕色瓶中。
2mol/L醋酸钠：取无水醋酸钠16。4克，用蒸馏水溶解后配成100毫升
95％乙醇

操作步骤
RNA提取：将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克.
取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次.
移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却.

离心,3000转/分,10-15分,上层为稍混浊,含有RNA的水相,中层为变性蛋白,下层为酚液,管底残渣,含有RNA.吸出上层水溶液要RNA的收获量,可向中下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液,同样在65度水浴中振摇提取一次,离心后所收得的上层水液,可与上述水液合并,本次实验只提取一次.
用量筒测水液的量,加入1/10体积的2mol/L醋酸钠混匀.再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇混匀,冷却放置絮状沉淀充分形成.

离心3000转/分,10分钟,倾出上清(不要废弃,可倒入收集瓶,作蒸馏回收乙醇用.
沉淀用蒸馏水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸馏水,不断搅拌,至沉淀*溶解即可,待作含量测定.

提取过程

RNA含量测定 
标准曲线制作:取试管12只,按下表编号加入试剂,加毕,摇匀,沸水浴中加热25分钟,取出后冷水冷却,测定各管0D670为纵坐标,RNA浓度为横坐标作图

测定过程

管号/试剂ml
0

1

2

3

4

5

6

7

RNA标准液

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

蒸馏水

2.0

1.6

1.2

0.8

0.4

0

地衣酚试剂

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

取两支试管各加入0.2ml待测液，再加1.8ml水和2.0ml地衣酚试剂，加毕，摇匀，沸水加热25分钟，取出后冷水冷却，测定各管OD680为纵坐标，RNA浓度为横坐标作图并计算提出的RNA 的量。并计算出RNA的收率.