核酸抽提的基础技巧和方法

1、核酸抽提原理 

简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质*分离的过程。 

经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等）和盐（如Tris、EDTA、NaCl 等）。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如NaCl）等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如 GIT、GuHCl 等）裂解的，该方法已经成为了RNA 抽提的主流，却不是基因组DNA 抽提的主流。 

zui常用的纯化方法，一是PC 抽提+ 醇沉淀，二是介质纯化。*种方法是利用PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是*种纯化方法的一个变体，省略了PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的PCR。其它杂质-如多糖、多酚等的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。 

2、裂解方法的评价 

含蛋白酶的裂解方法，仍然可以认为是抽提基因组DNA 的。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组DNA“缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使zui终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组DNA 与蛋白质“缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组DNA 的特性占优势，则纯化时以DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致DNA 的损失。另外，象有些样品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。 

高浓度蛋白质变性剂（如GIT、GuHCl 等） 的裂解方法，是抽提RNA 的。总RNA 的抽提，zui重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，并且能迅速抑制住细胞内的RNA 酶，从而确保了RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品-主要是植物，其它绝大部分样品的RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。 

不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是zui高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现zui简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用PC 抽提的差一些。 

SDS 碱裂解法是质粒抽提的裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。该方法不一定要使用PC 纯化，但结合PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。 

PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性（即没有扩增出来的阳性）比例也比较高。该方法zui简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制PCR 反应杂质的东西，如Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是否是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着PCR 的抑制物量的降低。 

含CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组DNA 抽提的裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是CTAB 的质量，二是洗涤的*程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的CTAB，批号不同，效果就可以差别很大。洗涤去除CTAB 要比其它的盐难一些，同时，CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否*也是该方法成功与否的关键。