SSR标记实验步骤

SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不*相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。
优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；
（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；
（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。
缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。

操作程序：
取叶片→磨样→提取DNA→pcr扩增→电泳检测→染色→读带标记
1、DNA提取
按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下：
① 成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存；
② 加入600ul 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30～60分钟；
③ 取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇；
④ 12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中；
⑤ 加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液；
⑥ 干后用的洒精清洗，干后加适量TE
2、PCR扩增
模板DNA的浓度大约25ng/ul，扩增反应体系为20ul。具体如下：
Sterile ddH2O 11ul
PCR Buffer 3ul
dNTP-mix 0.5ul
Primer1 1ul
Primer2 1ul
Taq polymerase 0.5ul(2U/μL)
DNA 3ul
PCR扩增程序为：（2h30min）
① 预变性：94℃，5分钟；
② 变 性：94℃，40秒；
③ 退 火：55℃ 40秒；
④ 延 伸：72℃，1分钟；
⑤ 循 环：从2到4共38个循环；
⑥ 72℃下zui后延伸5分钟；4℃ 5min,扩增产物置于4℃的冰箱保存。
3、扩增产物的电泳分离
制胶→灌胶→上样→电泳
扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，步骤如下：
① 准备电极液（1×TBE）；
② 将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面；
③ 不预电泳；
④ 点样，电泳220v；
⑤ 拆板，并及时将内板、边条及梳子洗净。
4、凝胶染色
① 固定：10%醋酸，5分钟；
② 染色：10分钟；
③ 漂洗：dH2O，5～10秒；
④ Na2S2O3 1min 
⑤ 显色：甲醛- NaOH,直到满意为止；
⑥ 漂洗：dH2O，2分钟。
5、自封带封胶，读带标记，数码照相摄像，室温风干。