DNA重组实验方法

DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在dna连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5"端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃，反应12-16小时(过夜)，这样既可zui大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。


(一)仪器
1．恒温摇床
2．恒温水浴
3．恒温培养箱
4．小型高速离心机
(二)材料
1． 氨苄
2． BamHI
3． HindIII
4． T4 DNA连接酶
5． pQE-31 和pUC18-CAT 质粒
6． 培养皿
7． 接种针
8． 金属涂棒
9． 1.5mL 离心管
10．酒精灯
11．镊子、灭菌牙签等
(三)试剂
DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申

[实验步骤]
(一)质粒DNA
用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。
(二)制备重组DNA
1．在灭菌的1.5mL 离心管中，加入pQE-31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。
2．在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18-CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反应液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反应过夜。
3．反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否*。酶切*，进行下一步。
4．将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。
5．将回收的pQE-31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：
在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。
(三)转化感受态细胞
1．用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。
2．在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。