反向PCR技术

引言

通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两 侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上 的dna片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步 查(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。

要得到边侧序列的探针一般需要进行一系列费时、费力的工作，首先用内切酶裂解和 用已知边侧序列的探针southern杂交以确定大小适合于克隆的末端片段;这些片段还 要经过凝胶分离、克隆，得到的物质再与已知边侧区域杂交以确定合适的克隆子。要 测定未吞边侧区序列时，通常需要从克隆中进行各种片段的亚克隆。

为避免这些步骤，我们采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。典型的PCR扩 增使用与互补链杂交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向内跨过两个引物之 间的区域。一个引物的DNA合成产物作为另一个引物的模板，进行DNA变性、引物退 火，dna聚合酶管伸反应的多次重复性循环，可使引物规定区域的拷贝数成指数增 加。但用传统PCR方法得不到紧邻引物外侧的DNA序列，因为寡聚核苷酸所引导的既有 目的DNA又有引物外侧区的DNA合成在拷贝过程中只呈线性增长，这种线性增长是因 为，对于每种引物来讲，其不能引导DNA反向合成(3"-5").

几乎是同时，有三个实验室分别设计出一种方法，使PCR可以扩增边侧区域。该方法 (反向PCR)的基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形 成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。用与核心区末端同源的引物，但其 3"端趄向未知区域，可以进步用pcr扩增环中的未知区域，该方法如图1所示。

反向PCR程序

Ochman等。在一些实验中，为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环 化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切 酶失活。在我们实验中，不必裂解环状分子核心区也可得到有效的PCR扩增。(这显然 不同于Silver和Keerikatter[7]的实验结果，他们报道在核心裂解使模板线性化后， PCR扩增率增加100倍，但Triglia[5]等则发现裂解环状分子与加热引起随机缺口效果 相同)。

聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。