PCR产物克隆方法

通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3"末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3"突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4dna连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3"末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法 克隆PCR产物。

粘端连接

引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5"末端可以增加一些非 互补碱基，因此可以在两引物的5"末端设计单限制酶或双限制酶切 位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互 补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计 不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5"端多合成3—4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切 效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至 数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3"末端序 列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5"端改变1个或 几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的 长度，而且酶切效果优于5"加端法。对于特定DNA

段的克隆，此方 法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5"加端法 更为适宜。

T4DNA聚合回切产生粘端

如PCR两引物的5"末端是A或T，则可在 其5"端分别加上CG和CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下，用T4dna聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3"→ 5"外切酶活性而消去3"末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。 此DNA段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需 在PCR引物的5"端加2—4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。

T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3"末端加一个碱 基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3"端突出一个 胸苷的质粒dna来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3"末端各加一处胸 苷。因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅 一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时， 用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3"末端突出一个胸苷的T尾 载体，称为T－vector。用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们 使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3"末端加上一个 胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物，使平 端载体DNA分子的两个3"末端各加上一个T。用这种方法制备的T－vector 的不同之处在于前者3"末端不能与待克隆PCR产物的5"末端连接，仅 5"末端可与PCR产物的3"末端形成磷酸二脂键。

共环消解法：zui近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物，先用T4DNA连接酶催化 连接反应，使5"端带有限制酶切位点的扩增DNA段连接成共环结 构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA段。对于对称 性限制酶位点，只需在引蛾的5"末端加上一关识别序列，因为在串 接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制 酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切 点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。