体外神经组织细胞的培养

    体外神经组织细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养需要*的营养条件，对于底物的选择也比其他细胞苛刻。神经细胞在未处理的玻璃或塑料上不能很好地存活，但在胶原蛋白或D一多聚赖氨酸内能向外长出轴突。多肽神经因子和神经胶质细胞分泌的因子促进轴突生长。神经组织(nervous tissue)由神经元(neuron)和神经胶质细胞(netaroglia cell)组成。神经元是高度分化的细胞，在体外培养条件下难以增殖。因此，目前神经元的培养主要用于原代培养。

一、神经元的培养

(一)材料

．材料来源新生大鼠脑组织。

2．手术器械解剖剪、解剖镊、眼科剪和眼科镊。

3．24孔培养板和盖玻片使用前用0．0％PLL处理盖玻片，室温过夜。无菌蒸馏水清洗后，紫外线照射灭菌。

4．清洗液HBSS，添加20万IU／L和200rng／L。

5．消化液O．05％。

6．培养液

()接种培养液：DMEM，添加0％HS O．mmol／L丁二胺、33mmol／L葡萄糖、60mg／L、孕酮、0万I U／L和00mg／L。

(2)维持培养液：DMEM，添加5％FBS、0％HS 0．mmol／L丁二胺、33mmol／L葡萄糖、60nng凡孕酮、0mmol／L丙酮酸钠、5mg／L胰岛素、00mg／L转铁蛋白、0．％卵白蛋白、0μg／L NGF一β、0万I U／L和00mg／L。

(二)方法

．取材采用生后l周以内的新生大鼠，颈内动脉放血处死后，取脑组织，置于无菌平皿内。然后，用预冷的HBSS冲洗脑组织3次。在解剖显微镜下，剥离软脑膜和血管，取皮质。将皮质脑成mm3左右的小块。

2．消化将组织块放人0．05％中，在37℃水浴中振荡消化30min。用吸管轻轻吹打，然后用不锈钢网滤出组织块。

3．细胞悬液制备用HBSS收集组织块，将组织块研碎，用吸管反复吹打，制成细胞悬液。然后，移人5ml离心管中，室温下静置0min后弃上清液，重复冲洗细胞3次。向离心管内细胞沉淀中加入5ml培养液，用吸管反复吹打，离心(000r／min，lOmin)。

4．培养细胞弃去上清液，用培养液悬浮沉淀细胞，将细胞铺于培养板中的盖玻片上，在37℃条件下静置培养。每隔2～3d换液次。

(三)结果观察

    培养24h后，大部分神经元已贴壁生长。神经元胞体呈圆形或长杆状，核大而圆，核仁明显。可见有细小突起从胞体长出。3～5d后，细胞突起明显变长。lOd后，细胞聚集成束，并开始退化。可用微管相关蛋白、神经元特异性烯醇化酶和神经丝等免疫细胞化学方法鉴定神经元，培养的细胞中95％以上为神经元细胞。

(四)注意事项

    培养液中需加入高浓度的葡萄糖，以利于神经元的生长。如需维持神经元生长较长时间，可将盖玻片放在单层神经胶质细胞支持物上进行培养。