免疫组织化学细胞的组织浸蜡和切片

【资料简介】

组织经过脱水、透明后置人石蜡中，使组织变硬而利于切片的过程称为浸蜡。
为了使石蜡*取代组织中的透明剂，必须经3次浸蜡，每次时间为1h左右。本实验  室蜡的熔点一般为56～58~C，这种熔点的蜡较适中，经过此种石蜡浸透，包埋后切片顺利，连续性好，展片平整。
切片是免疫组化准备工作的zui后一步，其切片质量相对于常规组织切片来说要求更高，要切得薄而平整，并注意不可有刀痕。主要有石蜡切片、冰冻切片、塑料包埋切片、碳蜡切片等。在切片前还需对载玻片进行相应的处理。
一、载玻片的处理
免疫组化染色时间长，特别是双PAP、免疫金银染色等方法，所需时间更长，并要反复洗涤，切片在试剂中长时间浸泡，经多次洗涤，极易造成脱片而影响实验的结果。需采用以下方法处理：载玻片先置于洗洁液（或洗衣粉溶液）中煮沸30min，清水洗干净后放人清洁液中浸泡12—24h，漂洗，用蒸馏水清洗后置于烤箱内干燥，然后涂以切片黏合剂。
切片黏合剂的配制方法如下。
（1）明矾—明胶的配制方法  明矾、明胶各1g，加入到100ml 1％甘油中，加热至70~C熔化，并搅拌混合至*透明状，将切片浸入此液中几分钟，也可以涂在载玻片上，36℃2h后即可使用。
（2）合成乳胶—聚醋酸乙烯乳液的配制方法  合成乳胶是一种高分子乳化聚合物，具有高度黏合力，无毒、无臭、无腐蚀性。取合成乳胶10份，加蒸馏水90份，搅拌成10％的使用液备用。载玻片可以浸泡此液中，也可以涂片。浸泡时浓度稀一点；用于涂片浓度高一点，涂完后在36~C中5h后即可使用。
（3）多聚赖氨酸  0．05％多聚赖氨酸（分子质量200kDa）水溶液，临用时现配，电吹风吹干即可使用。
（4）进口切片黏合剂  此胶属树脂胶，国外作为木材的黏合剂。涂胶方法同（1），即直接涂片或浸入涂片。一般买回来的黏合剂需10％稀释。
（5）甲醛—明胶  1％明胶5mi，2％甲醛5ml，混合即可涂片。
（6）明胶—铬明矾—戊二醛黏合剂  载玻片在10％Extron中65℃清洗60min，用热水冲洗60min，双重蒸馏水洗2次，空气干燥，然后浸在0．5％明胶—0．05％铬明矾液（注：先将0．5％明胶60~C溶解，冷却后加入铬明矾）中，40~C浸浴lmin，空气干燥，用0。2％戊二醛（PBS配制）固定60min，PBS洗后，切片空气干燥，于4~C保存。
（7）白胶—多聚赖氨酸混合液—取进口切片黏合剂10ml，加10mg多聚赖氨酸混匀，即可用于涂片。
二、石蜡切片
石蜡切片不仅是常规病理中的重要切片形式，也是免疫组化研究中较常用的切片形式，它能满足免疫组化的连续切片要求。为了便于染色及观察，切片时应注意：①连续切片时应按顺序分离及贴片，不应颠倒；②贴片时应距载玻片一端至少1cm，一般靠一边，以利于显色安全；③用于免疫组织化学染色的蜡温应为56—58℃，切片水温在40℃左右，应先置于冷水中，然后再移人热水中，这样可以使切片能顺利展平；④切片刀要求快，切片要薄，无刀痕和皱褶，在染色时可减少非特异染色；⑤烤片时要注意，抗原性较强的组织可在60℃烤3—8h，抗原较弱的组织可于37℃恒温箱内过夜；⑥切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定簇的保护。
三、冰冻切片
冰冻切片的优点是能较完整地保存抗原性。组织细胞的某些抗原成分，特别是细胞膜抗原、受体抗原、酶及肽类抗原在石蜡切片的处理过程中，可不同程度遭受破坏或失去抗原性，而冰冻切片就能zui大限度地保护抗原。缺点是在冷冻过程中形态结构可能破坏，抗原易弥散，不能用于常规病检及回顾性研究。
目前大多采用恒冷箱冰冻切片机，将新鲜组织置于-25℃左右的恒冷箱中，待组织*冷冻后即可连续切片。其注意事项：①切片刀要快，并且预先冷冻，恒冷箱的温度一般调至-25℃左右，不能太低，否则组织表面易出现冰渣；②抗卷板的位置要适中，否则难成片；③贴片时动作轻而迅速，否则易出现皱褶；④组织从液氮内或-80℃取出，必须进行温度平衡后才能切成片，切完的组织如下次还用，应用冷冻头在没有*溶解前取下，密闭后低温保存。
切片后，应用电吹风冷风吹干或自然干燥。如在短时间内用，可全部进行固定，固定后，PBS洗，吹干后低温冰箱内保存。
四、碳蜡切片https://www.hbzhan.com/Login/default?Stand_DownLoadOperate
碳蜡切片与石蜡切片相似，碳蜡是水溶性蜡，因此切片时不需用水展片，只需贴在载玻片上，吹干即可。切好片应把碳蜡块密闭保存在干燥器内。另外，碳蜡切片不需脱蜡至水，切片可直接入水进行各种染色。