牡蛎疱疹病毒感染荧光PCR检测试剂盒说明书

【资料简介】

、 牡蛎疱疹病毒感染荧光PCR检测试剂盒简介 
货号：HB-909 
为了适应牡蛎疱疹病毒（OsHV）微变株的快速检测和疫病研究的需要，本公司参照OIE发布的
水生动物疾病诊断手册2.4.09章中的荧光PCR引物和探针序列和检测方法。经多次实验及系统优
化，开发了本试剂盒。应用本试剂盒进行核酸提前和PCR检测具有快速、灵敏、特异、准确 、
安全、操作简单、应用广泛等特点及优点。
2、 试剂盒组成 
试剂盒组成包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂，具体组成参见表 ：
表 ：试剂盒组成（50test/盒）
试剂盒组成成分 体积 
核酸提取试剂： 样品 DNA 提取液
 样品 DNA 提取液 2
 5ml× 管
500µl× 管
核酸扩增试剂： DEPC 水
OsHV 荧光 PCR 反应液
Taq 酶(5U/ul)
阴性对照
OsHV 荧光阳性对照
 5ml× 管
750µl× 管
40µl× 管
 ml× 管
 ml× 管
*保存条件：样品 DNA 提取液 、2 和试剂盒须在-20℃保存。 
3、 样本采集，存放及运输 
3. 样本采集 
采集活的或濒死的软体动物，幼体（00-200mg），仔体（00-200mg）或2-3 mm2
外套膜的切片，
保存在95%的乙醇中或者–80℃保存。
3.2 存放 
研磨后的样本在 2 ℃—8 ℃条件下保存应不超过 24 h；-70 ℃以下可保存，但应避免反复
冻融（zui多冻融 3 次）。
3.3 运输 
采用泡沫箱加冰密封进行运输。 
4、 检测步骤 
4. DNA 核酸提取操作方法(在样本处理区进行)： 
4.. 取 n 个 .5ml 灭菌 Eppendorf 管，其中 n 为待检样品数和一管阴性对照之和，对每个管进行
编号标记。(注：试剂盒中的阳性对照直接作为 PCR 检测的模板，无需提取核酸)
4..2 每管加入 00 µl DNA 提取液 ，然后分别加入待测样本和阴性对照各 00µl，一份样本换用
一个吸头；混匀器上震荡混匀 5 s,于 4℃～25℃条件下，2 000 r/min 离心 0 min。
4..3 尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入 0µl DNA 提取液 2，混匀器上震荡混匀 5s,于 4℃～25℃
条件下，2 000 r/min 离心 0 s。
4..4 00℃ 干浴或沸水浴 0 min；加入 90µl DEPC 水，2 000 r/min 离心 0 min，吸取上清，即为提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置于-70℃冰箱内保存）。
4.2 荧光 PCR 检测 
4.2. 牡蛎疱疹病毒感染荧光PCR检测试剂盒扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出荧光 PCR 反应液、Taq 酶，2000×g 离心 5 秒钟。每个样品测试反应体系配制见
下表 2。
表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 荧光 PCR 反应液 Taq 酶 合计
用量 4.5 μL 0.5μL 5μL
4.2.2 加样（样本处理区进行）：
向每个PCR管中各分装5μL的混合液，再分别加入样本DNA模板0μL，盖紧管盖，500 r/min
离心 30 s。
4.2.3 荧光 PCR 检测（在检测区进行）：
循环条件设置：
*阶段，94o
C/3 min；
第二阶段，92o
C/5 s，55o
C/5s，60 o
C/30 s； 40个循环；在每次循环的60 o
C退火延伸时收集
荧光。
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
5、 结果判定 
5. 结果分析条件设定 
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样
品扩增曲线的zui高点为准。
5.2 质控标准 
5.2.阴性对照无Ct值或无扩增曲线。
5.2.2阳性对照的Ct值应<28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
5.3 结果描述及判定 
5.3.阴性
无Ct值或无扩增曲线，示样品中无OsHV核酸。
5.3.2阳性
Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在OsHV核酸。
5.4 有效原则
Ct>30的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
6、 相关技术信息 
6. 牡蛎疱疹病毒感染荧光PCR检测试剂盒引物序列 
OsHV F：5-’ GTCGCATCTTTGGATTTAACAA -3’
OsHV R：5-’ ACTGGGATCCGACTGACAAC - 3’
Probe：5’-FAM- TGCCCCTGTCATCTTGAGGTATAGACAATC -TAMRA-3’