鲑鱼传染性贫血病毒（ISAV）荧光 RT-PCR 检测试剂盒说明书

【资料简介】

、 鲑鱼传染性贫血病毒（ISAV）荧光 RT-PCR 检测试剂盒简介 
货号：HB-705- 
鲑鱼传染性贫血症, 英文名: Infectious Salmon Anaemia,简称 ISA。它的主要症状是严重贫
血，受感染后的鲑鱼大约在 2-3 周后死亡。不同的鲑鱼对 ISA 病毒有不同的敏感性，主要体征表现
为鱼眼球突出，腹腔积水，腹部器官出血，有时也会发生在皮肤上。肝脏或肾脏局部组织死亡。症
状的特征是贫血、腹水、脾肿大和在眼、皮肤和腹膜出血。实验已经证明，虹鳟，褐鳟鱼和鲑鱼可
能是 ISA 病毒无症状携带者。
为了适应鲑鱼传染性贫血症病毒（ISAV）快速检测和疫病研究的需要，本公司参考 205 年 OIE
水生动物疾病诊断手册 2.3.5 中规定的引物和探针序列，经多次实验及系统优化，开发了本试
剂盒。应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检
测等特点及优点。
2、 试剂盒组成 
试剂盒组成包括核酸扩增试剂。具体组成参见表 ：
表 ：试剂盒组成（50test/盒）
试剂盒组成成分 体积 
核酸提取试剂： 核酸裂解液 5ml×2 管
核酸扩增试剂： DEPC 水
ISAV 荧光 RT-PCR 反应液
酶混合物
阴性对照
ISAV 荧光阳性对照
ml× 管
750µL× 管
60µL× 管
ml× 管
ml× 管
（注：核酸提取试剂可使用本公司的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取试剂盒》） 
3、 样本采集,存放及运输 
3. 样本采集：所用取样器材必须经高压灭菌并烘干。
取新鲜鱼类组织脏器（肝、脑、脾、肾）2g 于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加 5ml PBS混匀，2 000r/min 离心 0min 取上清转入无菌离心管中备用。或取有可疑细胞病变的细胞悬液用于检测。
3.2 存放：研磨后的样本在 2 ℃—8 ℃条件下保存应不超过 24 h；-70 ℃以下可保存，但应避免反复冻融（zui多冻融 3 次）。
3.3 运输：采用泡沫箱加冰密封进行运输。4、 荧光 RT-PCR 检测 
4. 操作方法 
4.. 样本的处理（在样本制备区进行）：
4... 取 n 个灭菌的 .5 mL Eppendorf 管，其中 n 为被检样品与阴性对照的和（阳性对照、阴性
对照在试剂盒中已标出），做标记。
(注：试剂盒中的阳性对照直接作为一步法RT-PCR检测的模板，无需提取核酸) 
4...2 每管加入 600 µL 裂解液，分别加入被检样本和阴性对照各 200 µL，一份样本换用一个吸
头，混匀器上振荡混匀 5 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用
手颠倒混匀），于 4℃ 2 000 r/min 离心 5 min。
4...3 取与 4... 相同数量灭菌的 .5 mL Eppendorf 管，加入 500 µL 异丙醇（-20℃预冷），
做标记。吸取 4...2 各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取 500µL，不能吸
出中间层，颠倒混匀。
4...4 于 4 ℃、2 000 r/min 离心 5 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)；加入 600 µL 75％
乙醇，颠倒洗涤。
4...5 于 4 ℃、2 000 r/min 离心 0 min（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。
4...6 4 000 r/min 离心 0s（Eppendorf 管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。
4...7 加入 µL DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 离心 5 s，冰上保存备用。提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需保存须放置-70 ℃冰箱内。
【也可参照《病毒 RNA 柱式提取试剂盒说明书》（货号：HB-QPCR-0）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 须在 2 h 内进行 PCR 扩增；若需保存须放置-70 ℃冰箱内。 
4..2 鲑鱼传染性贫血病毒（ISAV）荧光 RT-PCR 检测试剂盒检测
4..2. 扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出相应的荧光 RT-PCR 反应液、酶混合物，在室温下融化后，2000 r/min 离心 5 s。
设所需荧光 RT-PCR 检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见表 2：
表 2 每个样品测试反应体系配制表
试剂 RT-PCR 反应液 酶混合物
用量 5 μL .0 μL
根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装6 µL，转移至样本处理区。
4..2.2 加样（样本处理区进行）：
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤4...7中制备的RNA溶液各0 µL，盖紧管盖，500 r/min离心30 s。4..2.3 荧光 RT-PCR 检测（在检测区进行）：
将4..2.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。
循环条件设置：
*阶段，反转录42 o
C /30 min；
第二阶段，预变性92 o
C/3 min；
第三阶段，92 o
C/0s，60 o
C/30s，72 o
C/20s，40个循环，在第三阶段每次循环的60 o
C退火延
伸时收集荧光。
试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
4.2 结果判定 
4.2. 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zui高点为准。
4.2.2 质控标准
4.2.2. 阴性对照的 Ct 值应<28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
4.2.3 结果描述及判定
4.2.3. 阴性
无Ct值或无扩增曲线，示样品中无ISAV核酸。
4.2.3.2 阳性
Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在ISAV核酸。
4.2.3.3 有效原则
Ct值>30的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。
5、 鲑鱼传染性贫血病毒（ISAV）荧光 RT-PCR 检测试剂盒相关技术信息（引物和探针序列） 
5’-CTA-CAC-AGC-AGG-ATG-CAG-ATG-T-3’
5’-CAG-GAT-GCC-GGA-AGT-CGA-T-3’
5’-6FAM-CAT-CGT-CGC-TGC-AGT-TC-MGBNFQ-3’