细胞总蛋白的提取及操作方法

【资料简介】

1、细胞总蛋白的提取

（2）裂解缓冲液：
50mM Tris-HCl pH7.6 或20mM Hepes pH7.4
150-300mM NaCl
1％（w/w）NP-40 （0.5%Triton-X100）
5mM EDTA（现加1ml加10ul）
临用前加入蛋白酶抑制剂：
Na3VO4
钒酸钠 1mM （75mM—13.3ul/ml）
（用0.2mol/L储存液配制）
PMSF苯甲酰氟 1mM （10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml）
或10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加10-20ul）
Aprotinin * 10ug/ml（10ul/ml）
（Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加） Western blotting

（2）给你介绍一个裂解液：
50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含：
NaCl 150mM
叠氮钠 0.02%
SDS 0.1%
NP-40 1%
PMSF 100ug/ml（使用前临时加入）（10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml）
尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，用6xSDS 上样buffer。

（3）悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS（0.01M）中，加入饱和浓度一抗（1/10）或
（10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000 转×3分，用PBS 0.4-0.5ml重悬（室
温）,加入饱和浓度二抗（1/100）或 （20ug/ml）,迅速置于37℃水浴中2-5分后
（迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uM Na3VO4
,5mM EDTA,10mM NaF））,

（4）离心4000 转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml（裂解浓度
108/ml？）吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml
的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细
胞溶解成分。

2、碧云天公司
Western 及IP 细胞裂解液的主要成分为20mM Tris（pH 7.5），150mM NaCl，1%
Triton X-100，以及焦磷酸钠, β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin
等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。（-20
℃保存，一年有效。）
如果是贴壁细胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量
的1/20）加入裂解液。

3、军科院
裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100ug/ml
PMSF）：
1mol/L Tris?HCl（pH8.0） 2.5ml
NaCl 0.438g
TritonX－100 0.5ml
蒸馏水至 50ml
混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF 至终浓度为100ug/ml（0.87ml 裂解液
加入1.74mg/ml PMSF50μl）

4、我的样品蛋白是这样制备的：
（1）．将与腺病毒转染液共培养２４小时的细胞消化下来

（2）．离心收集细胞

（3）．向离心管里加入４０微升１×PBS 缓冲液，随后再加入４０微升2×Lamily
buffer （由tris碱和SDS 组成）裂解细胞

（４）．将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心．

（５）．测定蛋白浓度，加样电泳
我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白．胶的浓度应该没
问题。

5、细胞总蛋白操作方法：
（1）、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置
一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

（2）、每瓶细胞加 3ml 4 度预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min
洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将
PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。

（3）、按 1ml 裂解液加10 ul PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无
结晶时才可与裂解液混合。）

（4）、每瓶细胞加400 ul 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂
解培养瓶要经常来回摇动。

（5）、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪
将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）

（6）、于 4度下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷）

（7）、将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于－20 度保存。