*消化方法的改进

【资料简介】

实践出真知，华中农业大学的金丹总结了多个细胞的消化经验，对*消化方法进行了改进。
背景：对于绝大多数实验室培养的用作模型的细胞来说，细胞传代是一项*的工作，常用的传代方法为：向长满了细胞的培养瓶中加入足量*浸泡消化细胞一段时间后再分散细胞并传代。但是各种细胞对*的敏感度千差万别，有的细胞比如HEK293系列的极容易消化，而有些如RAW264.7几乎不能被*从瓶壁上消化下来。消化时间不够，后续的细胞分散就需要用机械力，这样对细胞损伤太大，而且往往达不到很好的效果；消化过度，则会引起某些敏感的细胞的死亡，对于广大新手来说，在培养细胞时*的消化程度很难把握。
方法改进：
1. *消化：细胞长满后，弃培养基，用无菌PBS或者0.25%的*溶液适量浸洗细胞一次，浸洗的目的是去除生活藏培养基中的血清等抑制*活性的物质，洗完后弃净洗液，再次用0.25%的*溶液润洗一次，洗完后小心丢弃洗液，此时瓶内还会残留很少的*溶液，盖好细胞瓶塞，放入培养箱进行消化直到对光可见明显的细胞间隙增大，瓶内变圆细胞开始整体脱落，此时加入生长培养基终止消化，后续轻微用移液器吹打即可很好的分散细胞。
2. 有些实验室采用添加EDTA的方法增加*的消化能力，但是添加的EDTA会大量螯合体系中的二价离子，如Ca2+，如此会导致细胞尤为环境及胞内离子的大量流失，容易对细胞照成更大的损伤。因此，本人改进的方法中不使用添加EDTA的*消化液。
3. 对于本身贴壁不牢但是又容易聚集生长的细胞，典型的例子就是HEK293,方法可以改进为：采用上述残液消化，但是在放入37度培养箱消化时培养瓶倒置，适当延长消化时间（HEK293:5-8min）；因为无论是直接倒出还是用吸管吸，培养瓶内残留的*还是很多，这类细胞极易从瓶壁上大块脱落后，在*溶液里面形成团状，极难被消化分散。
4. 对RAW264.7这类极难用*消化的细胞，可采用的改进方法如下：第二次用*浸洗时延长时间至5-10min，之后倒出*，剩余残液继续放回培养箱中进行消化10-15min，此时细胞可很容易的被吹打分散均匀。
结果：本实验室培养了COS7,HEK293,NIH3T3,HepG2,RAW264.7以及原代细胞等多种生长特性的细胞，从贴壁不牢固的COS7,HEK293等细胞到一般用细胞刮刀传代的RAW264.7,现在基本都采用这种传代方法，在传代培养是可以获得很好的单细胞悬液，对细胞的损害也比以前的方法（浸泡消化，添加EDTA）小很多，细胞生长状态良好。