滚环扩增（RCA）试剂盒说明书

【资料简介】

滚环扩增（RCA）试剂盒说明书
滚环扩增（rolling   circle   amplification，RCA）是近几年发展起来的一种核酸恒温扩增方法。以环状 DNA 为模板，通过一个短的 DNA 引物（与部分环状模板互补），在 phi29 DNA 聚合酶催化下将 dNTPs 转变成单链 DNA，此单链 DNA 包含成百上千个重复的模板互补片段。这种方法不仅可以直接扩增 DNA 和 RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。因其高灵敏度、高特异性和可操作性，RCA 技术在基础研究、实际检测、医疗诊断及纳米材料等方面都有很好的应用，结合细胞原位检测、单核苷酸多态性 SNPs， 蛋白质分析、免疫芯片和全基因组的扩增等研究都能发挥其巨大的优势。

本试剂盒配备的 phi29 DNA 聚合酶具有链置换和连续合成特性，可连续合成长达 70kb 的 DNA 片段。另外，该酶具有 3’→5’外切酶校读功能，合成的 DNA 片段保真性高。试剂盒配备的 Random Hexamers 为 6 碱基随机引物可对目标分子进行指数放大（通常放大 10000 倍）。

滚环扩增（RCA）试剂盒说明书RCA 的原理图如下：

滚环扩增（RCA）试剂盒说明书本产品具有下列特点：

即开即用，十分简单方便，用户不需要单独准备各成分。配方经过精心优化，长模板可以达  70kb。

高保真酶，所得 DNA 突变率低

本试剂盒可以进行 50 次 20uL 体系的 RCA 实验。

1. 纯化带有靶片段的环状 DNA 或长度在 10kb 以上的线状 DNA，将其准确定量并稀释到 2pg/uL。注意：碱变性法提取的质粒 DNA 都有残留的 RNA 污染，尽管电泳时看不见，但测 OD 时这些 RNA 会使得 DNA 浓度虚高。因此质粒 DNA 需要电泳时跟浓度已知的 DNA marker 比较来确定浓度。此方法误差在 2 倍之内，但可以接受。

2. 在 PCR 塑料管中加入不超过 5 uL 纯化好的模板 DNA，用量在 50pg 左右。如果体积不足 5uL，则用自备的超纯水补齐。同时做一个不加模板 DNA 模板的阴性对照。

3. 加入等体积（2.5uL）变性液，轻柔吹打混匀。

4. 室温放置 2 分钟。

5. 加入 2.5uL RCA 溶液 A。此时样品总体积为 10uL。

6. 在 10uL 样品中，加入 10 uL 的 RCA 溶液 B，轻柔吹打混合均匀。

7. 加入 1 uL phi 29 DNA 聚合酶（10U/uL），轻柔吹打混合均匀。

8. 30℃保温 24 小时。注意：反应时间不要短于 24 小时。使用 PCR 仪进行 30℃ 保温并打开热盖保温。如果采用 30℃水浴，在样品管中加入 30-50uL 石蜡油以防水分蒸发，因为 30℃长时间的水浴也能使水分蒸发到管壁，从而改变反应体系中各成分的浓度、降低 RCA 反应效率。

9. 65℃保温 10 分钟使 phi29 DNA 聚合酶灭活。注：由于 phi29 DNA 聚合酶有 DNA

外切活性，所以将其灭活以免干扰后续反应。

10. 立即取 5uL RCA 反应液进行电泳检测扩增效果，DNA 片段大小将在 10kb 以上， 可达 70kb。

11. 扩增的 DNA 可以用于后续试验或电泳检测。换一下
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