酶联免疫吸附试验C1q测定法

【资料简介】

 

1 原理包被于塑料板上的固相凝聚IgG与酶联C1q的结合受标本中免疫复合物的抑制，是一种竞争性抑制试验。为避免标本中内源C1q的干扰，应预先用IgG免疫吸附剂将其除去。

 

    2 材料

    （1） 聚苯乙烯反应板，酶联免疫检测仪。

    （2） 免疫吸附剂系结合有IgG的纤维素。取纤维素（5%，pH值105）与溴化*一起室温反应10min，用01mol/L*缓冲液（pH值80）充分洗涤。再与IgG一起于4℃下作用18h（20ml缓冲液中含3g纤维素和100mg IgG）。制备物用27mol/L*缓冲液（pH值80）配成20%（W/V）悬液，贮于4℃。

    （3） 酶联C1q用戊二醛法将辣根过氧化物酶标记C1q，再经超滤AmiconXM200滤膜）分离贮于－20℃。

    （4） 其他试剂002mol/L TrisHCl缓冲液（pH值90）；02mol/L TrisHCl缓冲液（pH

值7.4），以及含005%Tween20的同一缓冲液；02mol/L EDTA （pH值76）；酶底物溶液和中止液。

 

    3 方法

    （1） 包被凝聚IgG取经002mol/L TrisHCl缓冲液（pH值90）透析过夜的凝聚IgG（100μg/ml），加入聚苯乙烯板孔内，每孔100μl，37℃包被30min后，用缓冲液洗3次（第1次、第3次用02mol/L TrisHCl缓冲液（pH值74）；第2次用含005% Tween20的同一缓冲液） ,真空干燥，贮于4℃。

    （2） 取血清标本50μl，加入02mol/L EDTA（pH值76）50μl，室温作用10min，使内源C1 q游离，然后加入IgG免疫吸附剂500μl，室温振荡20min，再以500r/min离心5min，得到1∶10稀释的上清液。

    （3） 取已包被凝聚IgG的塑料反应板，每孔中加入上述上清液90μl，酶联C1q10μl（1∶100 ～200稀释液），室温下反应20min，然后用含02mol/L NaCl，005%Tween20的02mol/L  TrisHCl缓冲液（pH值74）洗3次，再加入100μl底物溶液（pH值60、01mol/L磷酸盐枸橼酸盐缓冲液50ml中，加入邻苯二胺20mg，30%（W/V）*10μl），室温放30min，加入2mol/L硫酸50μl中止反应，于492nm读取吸光值。如果定量，可用凝聚IgG制作标准曲线，测出免疫复合物的相对含量。