半胱氨酸（cysteine, Cys）含量测定试剂盒

【资料简介】

测定意义：

蛋白质含有三种含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中，Cys是一种含有巯基的含硫氨基酸，从甲硫氨酸转化而来，并且可与胱氨酸互相转化。Cys参与蛋白质二硫键的形成，经常是蛋白质活性中心的组成部分，还可以为其它生理生化反应提供巯基。此外，Cys大量积聚在皮肤和粘膜表面，在角蛋白生成中维持重要的巯基酶的活性，并且补充巯基，以维持皮肤的正常代谢，调节表皮下层的色素细胞生成的底层黑色素。具有美白、解毒、改善炎症和过敏性皮肤等作用。

测定原理：

Cys还原磷钨酸生成钨蓝，在600nm处有吸收峰；通过600nm吸光度，计算Cys含量。

自备仪器和用品：

低温离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、磷酸和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。用前1天，向试剂三中加2.5mL蒸馏水充分溶解，再加磷酸0.625mL，混匀后盖紧（防止水分散失）沸水浴2h；冷却后加10mL蒸馏水，4℃可保存2周。

标准品：液体×1瓶，1μmol/mL标准液，4℃保存。

半胱氨酸提取：

1. 液体样品中半胱氨酸提取：取0.1mL液体样品，加试剂一0.9mL，充分混匀，11000 rpm 4℃离心10min，取上清液，待测。
2. 组织中半胱氨酸提取：称取约0.1 g组织，加入试剂一1 mL，冰上充分研磨，11000 rpm 4℃离心10 min，取上清液待测。

测定操作：

1. 酶标仪预热30 min以上，调节波长到600 nm，蒸馏水调零。

2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入20μL蒸馏水，100μL试剂二，100μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A空白管。

3. 标准管：取1mL玻璃比色皿，加入20μL标准液，100μL试剂二，100μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A标准管。

4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入20μL上清液，100μL试剂二，100μL试剂三，混匀后室温静置15 min，于600nm处测定吸光值，记为A测定管。

样品中半胱氨酸含量计算：

1. 按液体样品的体积计算

半胱氨酸含量（μmol/mL）

=[C标准品×V标准品×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)]×（V样总÷V样）

=10×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)

C标准品：标准品浓度，1 μmol/mL；V标准品：反应体系中加入标准品体积，0.1 mL；V样：反应体系中加入样品提取液体积，0.1 mL；V样总：样品提取液，1mL。

2. 按鲜重计算

半胱氨酸含量（μmol/g FW）

=[C标准品×V标准品×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白)]×（V样总÷V样）÷W

=1×(A测定－A空白)÷(A标准－A空白) ÷W

W：样品质量，g。