免疫酶染色法

【资料简介】

（一） 原理
免疫酶染色法亦称免疫酶标组织化学法。标本制备后，首先将其内源酶抑制，接着即可进行免疫酶染色检查。常规的免疫酶染色法可分为直接法和间接法两种。前者固定标本中的抗原直接与酶标抗体结合，达到酶染色目的；后者是抗原先与其抗体（*抗体）结合后，再与酶标抗体（第二抗体）结合，而进行酶染色的。免疫酶染色法的酶底物产物为不溶性物质，可沉着于抗原上，使其显色。间接法虽然多一步骤，但使用范围广。此外，酶标记第二抗体可用酶标记SPA或生物素与亲和素系统等代替。

（二） 材料和方法（以检测空肠弯曲菌为例）
1 材料
（1） 去除内源性酶试剂：1%H2O2甲醇溶液。
（2） 空肠弯曲菌免疫血清（*抗体）：CjC37（鸡源）和CjP5（猪源）抗血清，自制。
（3） 驴抗兔IgHRP（第二抗体）：自制。
（4） 稀释液与洗液（pH值74 PBS）。
（5） 底物溶液（DABH2O2）：
①TrisHCl缓冲液（pH值76，005mol/L）。
②底物溶液，3，3二氨基联苯胺50mg、TrisHCl缓冲液100ml、过滤，4℃冰箱保存。用前加H2O2，zui终浓度为03%。
2 方法
（1） 标本制备：将疑似空肠弯曲菌病料或其培养物涂片，干燥，然后置除去内源性酶试剂中处理及固定10min。
（2） 冲洗：用PBS冲洗1次，沥干。
（3） 加抗血清：用稀释液对CjC37或CjP5抗血清（针对同源菌）作1∶160稀释，滴加在玻片上，置37℃于湿盒内孵育30min。
（4） 洗涤：3次。
（5） 加酶标记抗体：用稀释液对驴抗兔IgGHRP作1∶500稀释，滴加于玻片上，置37℃于湿盒内孵育30min。
（6） 洗涤：3次。
（7） 滴加底物溶液：室温作用20min，用自来水冲洗，终止反应，干燥，光学显微镜检查。

（三） 结果判定凡菌体被染成棕色或褐色，且形态弯曲者，均判为空肠弯
曲菌阳性；凡2～3个视野中，未发现被着色的弯曲形菌体或被鉴定菌不着色，均判为空肠弯曲菌阴性。

（四） 注意事项
1 涂片后，为了防止玻片上的标本面反置和号码混乱，应用一小片橡皮膏贴于玻片一端，并用铅笔编号。
2 滴加酶染色试剂时，玻片应沥干，并且各试剂滴加的量不宜过多，以防溢出。
3 孵育时，温箱内需放一水槽或将玻片置湿盒内孵育，防止酶染色试剂蒸发或干燥。