非洲猪瘟试剂盒的工作原理

【资料简介】

非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒使用说明书（快提核酸扩增试剂盒）

【产品名称】
通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）
英文名称：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［预期用途］
本试剂盒主要用于检测疑似感染猪抗凝血及临床病料中的非洲猪瘟病毒（ASFV, African Swine FeverVirus）核酸，适用于非洲猪瘟病毒的检测、辅助诊断和流行病学调查。

【试剂盒组分】
1、试剂盒组成及贮藏条件

名称	50T	贮藏条件
1、反应液A	ImL	-20°C
2、反应液B	ImL
3、阳性对照	250μL
4、阴性对照	250μL
5、PCR反应液	850μL
6、酶混合液	150μL

2、需自备材料：生理盐水、无菌枪头、荧光PCR专用反应管、记号笔等。

【操作步骤】

一、样品制备
1、 血液样品：采集抗凝血（抗凝剂为EDTA）或血清样品，编号备用。
2、 组织样品：采集脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体等病变组织样品或软蜱0.1g（黄豆粒大小），眼科剪剪碎于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加1mL生理盐水混匀，4°C条件下8000 rpm/分钟离心2分钟，取上清液于灭菌离心管中，编号备用。

二、DNA提取
取反应液A 20μL分别加入到新的1.5mL离心管，加入抗凝而或血清或组织上清液2μL混匀，室温（20°C左右）静置3分钟，加入反应液B 20μL,吹打混匀即可，若为抗凝全血，则需8000rpm/分钟再离心2分钟后做为待检DNA溶液。

二、PCR扩增
1、配液：取出PCR反应液、酶混合液，在室温*融化后，充分混匀，瞬离，可将酶混合液全部取岀直接加入到PCR反应液中，充分混匀，瞬离后按每份20μL分装使用；或按照每份PCR反应液17μL, 酶混合液3μL的比例取一定的试验用量，混合两种反应液,瞬离后按照每份20μL分装到专用荧光PCR 反应管中，剩余试剂立即冻存；（操作过程要注意避光）
2、加样扩增：分别向上述PCR反应管中加入5μL样本 DNA或阴性对照或阳性对照，混匀并瞬离, 放入荧光PCR仪上运行以下程序：

步骤	条件	循环数
50°C：2分钟	95 1
预扩増	°C：8 秒  5
95°C：8 秒  40

荧光通道选择FAM,在40循环阶段每个循坏的55°C时收集荧光信号。设置扩增体系为25μL,同时要选择 passive reference 和 quencher 为 none 的模式。
(注:若荧光PCR仪(如ABI7500)按说明书中的反应程序设置后因持温时间短无法运行,可将预扩增和PCR扩增条件变更为95°C： 5秒 55°C：30秒。) 

【结果判定】
1、基线和阈值设定；基线调整取6-15个循环的荧光信号，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照检测 荧光曲线的最高点为原则。
2、质量控制：反应结束后，阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，Ct值为＞38或无；阳性对照 的Ct值应≤30.0,且明显的扩增曲线；否则实验视为无效。
3、样品判定：待检样品荧光信号有指数型增加，且结果显示Ct值<35.0,报告为阳性；未检测到Ct 值或Ct值＞38或无明显扩增曲线，则样品判定为阴性。35≤Ct值≤8时，复检一次，重复结果为阳性者判定为阳性，否则判定为阴性。