霍乱弧菌荧光PCR检测试剂盒使用说明书

【资料简介】

 一、外标准模板DNA的制备

注：如果不需要自己制作浓度的标准曲线，此步可省略。如果不使用外标准模板，只能使用根据经验值得到的标准曲线方程。

1、 挑取单个阳性菌落，如569B、El Tor N16961、O139 MO45等（注意：本产品A型需用O1霍乱弧菌做阳性对照、B型需用O139霍乱弧菌做阳性对照）于LB 液体培养基中，在37℃摇床培养10 小时，然后显微镜下计算细菌的浓度。注意：由于所有阳性霍乱弧菌都有传染性，所以本公司不提供，需要用户自备。

2、 用自选方法抽提培养的阳性对照细菌的基因组DNA。注意：提取阳性细菌的方法应该与提取样品细菌的方法相同。

3、 用紫外分光光度计测定纯化所得阳性菌DNA的浓度和纯度，并计算出DNA量跟阳性细菌数的对应关系，即1 ug 阳性菌DNA对应多少阳性细菌。

4、 将纯化的阳性菌DNA 用超纯水用10倍系列稀释法稀释成到7个浓度梯度（相当于10¹-10⁷ cfu/mL），充分混匀后放冰上待用。

 

二、样品DNA的制备

1、 用自选方法抽提样品细菌的基因组DNA。注意：使用的方法应该跟上步提取阳性菌的方法相同。

 

三、荧光定量PCR（20uL体系）

1、 样品管：在PCR管中加入下列成分：

成分	加入量
PCR MagicMix 2.0	10 uL
PCR级绿如蓝染料	1 uL
待检测样品DNA（自备）	X
O1专一性PCR引物对（仅本产品A型提供） 或 O139专一性PCR引物对（仅本产品B型提供）	2 uL
1×ROX染料 （自备、见注）	2 uL
补水到	20 uL

注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX作对照。

2、 阴性对照共两管：一管用非霍乱弧菌的基因组DNA作为模板（可用实验室常用的BL21或DH5a大肠杆菌的基因组DNA）；另一管用水作为模板。两个阴性对照可以检验PCR反应的特异性。

3、 外标准反应共七管：用上步制备的7个浓度梯度的阳性菌DNA分别作为7个荧光PCR反应的模板。

 

四、荧光PCR反应参数：

过程	温度	时间	其他要求
预变性	95℃	3 分钟
PCR反应一 （10个循环）	95℃	10 s
	58℃	20 s	每次循环温度降低1℃
	72℃	15 s
PCR反应二 （40个循环）	95℃	10 s
	55℃	20 s	在此步收集反应的荧光数据，所选择波长见注。
	72℃	15 s

 

注：本产品所用荧光染料跟DNA结合时的zui大光吸收是500nm，zui大发射波长是530nm，不跟DNA结合时zui大吸收波长是471 nm，无发射。

 

五、数据处理

1、 用7个浓度的阳性菌标准样品所得的数据制作标准曲线，以细菌数的log为横轴，以荧光PCR反应的Ct值为纵轴。如果没有自己制作标准曲线，可以用本试剂的经验标准方程：Y＝－3.68lg（X）＋37.48， R2=0.99971。

通过样品DNA荧光PCR的Ct值反推出待测样品中的霍乱弧菌的数量：将样品DNA荧光PCR的Ct值作为Y值放入标准曲线方程式中即可计算出X（PCR体系中霍乱弧菌的数量）。