细胞计数及活力测定方法

【资料简介】

 

一、原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数.计数结果以每毫升细胞数表示.细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同.
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用.复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果.
用台盼兰染细胞,死细胞着色,活细胞不着色,从而可以区分死细胞与活细胞.利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力.
二、仪器、用品与试剂
1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）
2、试剂：0.4％台盼兰,0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇
3、材料：细胞悬液
三、操作步骤
（一）细胞计数
1、将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上.
2、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间.
3、静置3分钟.
4、镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的.然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液.
（二）细胞活力
1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中.
2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液,染色2一3分钟.
3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片.
4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力.
死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状.
活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用.
（三）MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围.其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比.
l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟,弃上清液.
2、沉淀加入0.5－1ml MTT,吹打成悬液.
3、37℃下保温2小时.
4、加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）.打匀.
5、1000 rpm离心,取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色,酸化异丙醇调零点.
注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞数.
附：1、0.4%台盼兰染液配制：
台盼兰 0.4克加双蒸水至100 ml.
2、MTT配制：
MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中.4℃下保存.
3、酸化异丙醇配制：
异丙醇中加入HCl使zui终达0.04mol/L.