ELISA检测试剂盒操作注意事项，大鼠（Rat）5羟色胺（5-HT）使用说明书

【资料简介】

大鼠（Rat）5羟色胺（5-HT）ELISA检测试剂盒使用说明书
检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预
先包被5羟色胺（5-HT）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、
HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物TMB显色，TMB
在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的
黄色。颜色的深浅和样品中的5羟色胺（5-HT）呈正相关。用酶标仪
在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞
刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地
分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟
取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于
-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
操作注意事项
1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的
浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解
后再使用。
2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明
书操作时样本已经稀释5倍，zui终结果乘以5才是样本实际浓度。
4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称 96孔配置 48孔配置 备注
微孔酶标板 12孔×8条 12孔×4条 无
标准品 0.3mL*6管 0.3mL*6管 无
* 6mL 3mL 无
检测抗体-HRP 10mL 5mL 无
20×洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释
底物A 6mL 3mL 无
底物B 6mL 3mL 无
终止液 6mL 3mL 无
封板膜 2张 2张 无
说明书 1份 1份 无
自封袋 1个 1个 无
注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、7.5、15、30、60、120ng/mL
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓
冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽
孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步骤
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封
袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 样本孔先加待测样本10μL，再加*40μL；空白孔不
加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶
（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴
锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去
洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的
OD值。
结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应
OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样
本浓度值。
试剂盒性能
1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于
0.9900。
2. 灵敏度：zui低检测浓度小于1.0ng/mL。
3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6. 有效期：6个月
免责声明
1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所
产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者
承担。
FOR FORRESEARCHUSEONLY.
NOTFORUSEINDIAGNOSTICPROCEDURES.
Rat5-Hydroxytryptamine（5-HT）ELISAKit
instruction
Intendeduse
This5-HISAkitis intended Laboratoryfor Researchuseonlyandis notfor
usein diagnosticortherapeutic procedures.TheStopSolutionchangesthe color
from blueto yellowandthe intensity ofthe coloris measuredat450nmusinga
spectrophotometer. In orderto measurethe concentrationof5-HTin the sample,
this 5-HT ELISAKitincludes a set of calibration standards. Thecalibration
standards areassayedatthe same time asthe samples andallowthe operatorto
produce a standard curve of OpticalDensityversus 5-HT concentration. The
concentrationof5-HTin the samplesis then determinedbycomparingthe O.D.of
thesamplestothestandardcurve.
Samplecollectionandstorages
Serum- Useaserum separator tube andallowsamples to clotfor 30minutes
beforecentrifugationfor10minutesatapproximay3000×g.Removeserumand
assayimmediay oraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoid repeated
freeze-thawcycles
Plasma- CollectplasmausingEDTAorheparinasananticoagulant.Centrifuge
samplesfor 30minutesat3000×gat2-8℃within30minutesofcollection.Store
samplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Cellculturesupernatesandotherbiologicalfluids-Removeparticulates
bycentrifugationandassayimmediay oraliquotandstore samples at-20℃or
-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Note: Thesamplesshoulebecentrifugateddequayandnohemolysisor
granulewasallowed.
Materialsrequiredbutnotsupplied
1. Standardmicroplatereader（450nm）
2. PrecisionpipettesandDisposablepipettetips.
3. 37℃incubator
Precautions
1. Donotsubstitutereagents fromonekit toanother. Standard,conjugateand
microplatesarematchedforoptimalperformance.Useonlythereagentssuppliedby
manufacturer.
2. Donotremovemicroplatefromthestoragebaguntil needed.Unusedstrips
shouldbestoredat2-8°Cintheirpouchwiththedesiccantprovided.
3. Mixallreagentsbeforeusing.
Removeallkitreagentsfromrefrigeratorandallowthemtoreachroomtemperature
（20-25°C）
Materialssupplied
Name 96determinations 48determinations
Microelisastripplate 12*8strips 12*4strips
Standard 0.3ml*6tubes 0.3ml*6tubes
SampleDiluent 6.0ml 3.0ml
HRP-Conjugatereagent 10.0ml 5.0ml
20XWashsolution 25ml 15ml
ChromogenSolutionA 6.0ml 3.0ml
ChromogenSolutionB 6.0ml 3.0ml
StopSolution 6.0ml 3.0ml
Closureplatemembrane 2 2
Usermanual 1 1
Sealedbags 1 1
Note:Standard（S0→S5） concentration wasfollowed by:0,7.5,15,30,60,120
ng/ml
Reagentpreparation
20×washsolution:DilutewithDistilledordeionizedwater1:20.
Assayprocedure
1. Prepareall reagentsbeforestartingassayprocedure.It isrecommendedthat
all StandardsandSamplesbeaddedinduplicatetotheMicroelisaStripplate.
2. Addstandard: SetStandardwells, testing samplewells.Addstandard50μl to
standardwell.
3. AddSample: AddSample10μl ThenaddSample Diluent40μl to testing
samplewell;Blankwelldoesn’taddanyting.
4. Add100μlofHRP-conjugatereagenttoeachwell,coverwithanadhesivestrip
andincubatefor60minutesat37°C.
5. Aspirateeachwellandwash,repeatingtheprocessfourtimesforatotaloffive
washes.WashbyfillingeachwellwithWashSolution（400μl）usingasquirtbottle,
manifolddispenser or autowasher. Completeremoval of liquid at each step is
essentialto goodperformance.Afterthe last wash,remove anyremaining Wash
Solutionbyaspiratingordecanting.Invertthe plateandblotit againstcleanpaper
towels.
6. AddchromogensolutionA50μl andchromogensolutionB50μl to eachwell.
Gentlymixandincubatefor15minutesat37°C.Protectfromlight.
7 Add50μlStopSolutiontoeachwell.Thecolorinthewellsshouldchangefrom
bluetoyellow.Ifthecolorinthewellsisgreenorthecolorchangedoesnot
appearuniform,gentlytaptheplatetoensurethoroughmixing.
8. ReadtheOpticalDensity（O.D.） at450nmusingamicrotiter platereader
within15minutes.
Calculationofresults
1. Thisstandardcurveis usedto determinethe amountin anunknownsample.
Thestandard curve is generated by plotting the average O.D.（450 nm）
obtainedfor eachofthe sixstandardconcentrationsonthe vertical（Y） axis
versusthecorrespondingconcentrationonthehorizontal（X）axis.
2. First,calculatethe meanO.D.valuefor eachstandardandsample.AllO.D.
values,aresubtracted bythe meanvalueofthe zerostandard beforeresult
interpretation. Constructthe standard curve usinggraphpaperorstatistical
software.
3. Todeterminethe amountin eachsample, first locate the O.D.valueonthe
Y-axisand extend a horizontalline to the standard curve. Atthe pointof
intersection, drawa verticalline to the X-axisand read the corresponding
concentration.
4. Anyvariationin operator,pipettingandwashingtechnique, incubationtime or
temperature, andkitagecancausevariationin result.Eachusershouldobtain
theirownstandardcurve.
5. Thesensitivitybythisassayis1.0ng/ml
6. Standardcurve
Storage：2-8℃.
validity：sixmonths.
FORRESEARCHUSEONLY;NOTFORTHERAPEUTICOR
DIAGNOSTICAPPLICATIONS!PLEASEREADTHROUGH
ENTIREPROCEDUREBEFOREBEGINNING!