PCR法DNA探针标记试剂盒使用说明书

【资料简介】

 PCR法DNA探针标记试剂盒

PCR DNA Probe Labeling Kit

原理及特点PCR标记的原理是用带标记的dNTP进行PCR，zui后得到的PCR产物将带有标记，可以直接用于杂交试验。其原理示意图如下：

PCR法制备DNA探针示意图

 

本产品在上述原理的基础上本产品的特点是：

1.一站式，不需要自己单独准备标记的核苷酸。

2.可用于各种同位素标记和其他任何非同位素标记（90604A，但需自备标记底物，底物包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP）、其中90604B和90604C可直接用于*和地高辛标记，不需自备标记底物。

3.本试剂盒提供的dNTP中，标记和非标记dNTP的比例经过优化，不需要自己摸索。本产品得到的探针参入率一般为4-5%（每100个核苷酸中有4-5个将带有非同位素标记）。

4.如果使用非同位素标记，得到的DNA探针将非常稳定，可低温长期放置。

5.可以用于Southern 和Northern Blot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析。

规格及成分成份5次塑料袋包装

PCR Buffer 10×

（含15 mM MgCl2）50 uL

Taq DNA 聚合酶（5U/uL）25 uL

MgCl2（25 mM）50 uL

dATP、dTTP、dTP、dGTP各5 uL,共四管

标记dNTP（含Biotin-11-dUTP）5 uL （B和C型有）

对照引物混合物（10 uM）10 uL

对照模板DNA5 uL

超纯水1 mL

使用手册1份

注：A型用于同位素标记或自选标记，四种dNTP每种5 uL，分开提供，每种浓度为2 mM；B型提供含Biotin-11-dUTP的dNTP混合物，用于*标记；C型提供含DIG-dUTP的dNTP混合物，用于地高辛标记。

 

运输及保存低温运输，-20℃保存，有效期一年

自备试剂DNA模板和模板专一性引物。

使用方法一：优化PCR条件

1.设计引物时，使PCR产物的长度在300-2000 bp之间。过短则标记参入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。

2.由于用户的探针各不相同，所以需要用户先自行优化PCR条件，不能有非特异扩增，因为标记的非特异扩增产物会引起杂交后检测时的高背景甚至假阳性。一旦优化，请不要更改PCR参数和任何成分（用哪个批次做优化实验，就用同一批次做标记实验）。本试剂盒提供的Taq DNA聚合酶和PCR Buffer、MgCl2足够45次10 uL的优化反应和5次10 uL的标记反应用，但优化用的dNTP需要自备。

3.双链PCR探针在杂交前虽然要变性成单链，但杂交时它们彼此还会复性，与探针与靶片段的结合反应相竞争，降低检测效率。因此为进一步提高探针检测灵敏度，用于单基因检测等试验，强烈建议通过控制两条引物的比例来实现单链PCR，制备高灵敏度的单链DNA探针。单链PCR条件也需要优化，一旦优化，请不要更改PCR参数和任何成分（用哪个批次做优化实验，就用同一批次做标记实验）。

4.回收非标记PCR产物作为电泳对照。

二：探针标记及电泳检测

1.按下表设置一个10 uL的标记反应体系。

成份用量

PCR Buffer, 10×1 uL

标记dNTP（见注）1 uL

模板专一性引物一（自备）1 uL（10 uM）

模板专一性引物二（自备）1 uL（10 uM）

模板DNA（自备、总量不超过1 ug）1 uL

Taq DNA聚合酶（5U/uL）1 uL

超纯水补到10 uL

2.用*步优化的PCR参数进行标记PCR。

3.取标记反应产物1 uL，在琼脂糖凝胶上电泳,用回收的非标记PCR产物（同样的引物和模板扩增得到，只是没标记）。由于标记反应的PCR产物中有非同位素的参入、因此泳动速度将慢于非标记PCR产物（但同位素标记不能用此法）。下图是一个典型的电泳结果图：

 

标记的DNA（右）与未标记的DNA（左）电泳比较

4.剩余的标记产物可以不经过纯化，直接加热变性后加入（对双链探针）或直接加入（对单链探针）杂交液中使用或者放-20℃长期保存。

5.如果要准确检测标记效率（一般不必），取标记产物1μL和DIG标记的对照DNA（另售），用DNA稀释液（另售）按10倍系列稀释后点样于带正电荷尼龙膜上。用紫外交联仪或真空烘烤固定DNA探针，按DIG杂交检测试剂盒的方法进行信号检测，然后与膜条上的DIG标记的对照DNA信号强度对比，推算出标记的探针浓度。如初始模板量较大，可取1 μL标记产物稀释10~100倍后定。

6.如果有必要，可以用本试剂盒提供的对照模板和对照引物做按下表做对照标记PCR反应，所得产物长度为3000 bp：

程序名称参数

预变性94℃ 4min 

PCR

（30个循环）94℃ 1 min

55℃ 1 min

72℃ 3 min

延伸72℃ 5 min

 

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