细胞实验技术汇总-细胞组分的化学反应

【资料简介】

细胞实验技术汇总-细胞组分的化学反应
【实验目的】

了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握 Brachet 反应及碱性蛋白、酸

性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。

【实验用品】

一、材料和标本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的 Hela 细胞。

二、器材和仪器 光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、

水浴箱。

三、试剂 PBS 缓冲液（pH7.2）、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2 丙酮+1/2 二

甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸

铜、联 苯胺混合液、1 ％番红、无 水乙醇、过 碘酸酒精液、S chiff 氏酒精液、亚 硫酸水、E hrlieh

苏木精、95％乙醇、Carnoy 固定液（甲醇：冰醋酸=3:1，体积比）

【实验内容】

细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内

的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生

物化学成分进行定性、定位、定量研究。

一、Brachet 反应一显示细胞内的 DNA 和 RNA

（一）原理

细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的 DNA 和 RNA 出现不同的呈色反应，一般

认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的

作用有选择性，甲基绿染高聚分子的 DNA 呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的 RNA 呈红色。由

此对细胞中的 DNA 和 RNA 进行定位、定性、和定量分析。

（二）方法

l．接种 Hela 细胞于盖片上并培养 24～48 小时，使长成单层。

2．取出盖片，用 PBS（pH7.2）轻轻冲洗盖片表面去除残渣。

3．放入 Carnoy 固定液中固定 l 小时。

4．浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中 30 分钟染色。

5．取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗 2～3 次（2～3 秒钟左右），吸去水分。放入纯丙酮

中分色 2～3 秒钟。

6. 放入 l／2 丙酮+1／2 二甲苯中 5 秒钟。

7．放入纯二甲苯中透明 5 分钟。

8．滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片。

9．镜下观察

（三）结果

细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，而其中核仁被染成紫红色（参照照片）。

二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示

（一）原理

由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在 pH 值不同的溶液中，蛋

白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性

蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用

不同 pH 值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。

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（二）方法

1．以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将

心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温

晾干。

2. 将涂片作好标记放在 70％乙醇中固定 5 分钟，室温晾干。

3．放入 5％三氯醋酸中 60℃30 分钟，抽提出核酸。

4．清水冲洗多次（3 分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。

5．滤纸吸干玻片上水分。

6. 一张片放入 0.1％碱性固绿（pH8.0～8.5）中染色 10～15 分钟,另一张片放入 0.1％

酸性固绿（pH2.0～2.5）染色 5～10 分钟。

7．清水冲洗，盖上盖片镜检。

（三）结果

经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白

质存在处（参照照片）。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。

三、细胞内过氧化物酶的显示

（一）原理

过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物

酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定

过氧化物酶的有无或多少。

（二）方法

1．取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜

向剪断，用 PBS 缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。

2．推片，室温晾干。

3．将涂片放入 0.5％硫酸铜中浸 30 秒~1 分钟。

4．取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应 6 分钟。

5．清水冲洗，放入 1％番红溶液中复染 2 分钟。

6．清水冲洗，室温晾干。

7．镜检或封片后镜检。

（三）结果

涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。

四、过碘酸雪夫反应（PAS）——显示细胞内糖原（参照照片和示教片）

（一）原理

组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS 法来显示，其化学基础是利用过碘

酸的氧化作用，打开碳链形成醛，生成的醛基与 Schiff 试剂中的无色品红反应形成紫红色

化合物。

（二）方法

l．取 l~2mm 厚的肝组织块，用 Carnoy 氏液 4℃固定 4～6 小时。

2．乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋，切片。

3．用 70％乙醇展片。

4．脱蜡：二甲苯（1）5 分钟→二甲苯（2）5 分钟→100％乙醇 5 分钟→含 1％火棉胶的乙

醇液 1 分钟→70％乙醇 1 分钟。

5．直接浸入过碘酸酒精液反应 5～15 分钟，经 70％乙醇洗片刻。

6．浸入 Schiff 氏酒精液反应 15 分钟。

7．亚硫酸水洗三次，以洗去多余的非特异性结合的色素，以及扩散的染料。

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8．流水冲洗 3～5 分钟。

9．蒸馏水洗。

10．浸入 Ehrlich 苏木精复染 20~30 秒，使细胞核着色。

11．脱水：95％乙醇 3 分钟二次→100％乙醇 3 分钟二次→二甲苯透明 10 分钟二次。

12．加盖片镜检或树胶封固后镜检。

（三）结果

细胞中呈紫红的颗粒即为糖原（参照照片）。

五、苏丹Ⅲ染色——显示细胞内脂肪（示教片）

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