技术讲解：λ噬菌体DNA提取方法

【资料简介】

λ噬菌体是zui早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染;其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体培养时，裂解生长使菌液中宿主菌zui后全部被裂解而释放出大量的噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十kb的外源DNA。许多cDNA和基因组文库是以λ噬菌体作为克隆载体构建的。因此，在经文库筛选得到目的克隆后，我们常常需要利用λ噬菌体裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体DNA来开展进一步的工作。

一、试剂准备

1. LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用）5g，NaCl 10g，加ddH2 O 至1000ml，*溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。

2. 1.5%琼脂LB固体培养基：称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶，加100mlLB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。

3. 20%麦芽糖：麦芽糖20g，加ddH2O 至100ml，0.22μm滤膜过滤。

4. SM液：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g，1M Tris·CL（PH7.5）50ml，2%明胶 5ml，加ddH2O 至1000ml。15lbf/in2高压灭菌20min。

5. RNase A 10mg/ml，TE配制，沸水浴15min，分装后贮存于-20℃。

6.DNase I 10mg/ml，TE配制，分装后贮存于-20℃。

7. PEG 8000

8. 10%SDS

9.EDTA: 0.5M pH8.0

10. /氯仿/异戊醇（25：24：1）

11. 异丙醇

12. 无水乙醇、70%乙醇

二、操作步骤

1. λ噬菌体平板培养

① 用SM液10倍梯度稀释λ噬菌体原种。

② 取0.1ml各梯度稀释离心到一消毒微量离心管中，加0.2ml新鲜培养的宿主菌，加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mm），37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。

③ 取熔化（47℃）0.7%琼脂LB固体培养基3ml与上述管混匀，立即倒入预备（2-4天）的含凝固1.5%琼脂LB固体培养基的平板内，轻轻晃动平板使均匀分布。

④ 37℃培养6-8hr后，观察噬斑形成。

⑤ 用剪去部分头部的吸头挖取单个噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震荡。37℃温育10min。

⑥ 重复⑴-⑷，获得单个噬斑滴度。

2. λ噬菌体液体培养

① 取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4ml LB培养基重悬，加λ噬菌体0.1ml（新鲜获得的单个噬斑，依滴度使之与宿主菌比约1/500-1000）。

② 加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。

③ 加到100ml LB液体培养基中，加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃摇震培养9-12hr后可见裂解发生。

④ 加0.1ml氯仿，37℃继续摇震培养10-20min。

二、λ噬菌体DNA提取

1. 将上述裂解液转移至离心管，离心8000g×10min，去细菌碎片，取上清液。

2. 加RNase A、DNaseI 至1μg/ml， 37℃温育30min。

3. 加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1hr或4℃过夜。

4. 4℃离心10000g×20min，去上清液。

5. 加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量离心管，加20μl 10%SDS，20μl 0.5M EDTA，68℃15min。

6. 加等体积/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000g×5min，取上层液到一新微量离心管，加等体积氯仿/异戊醇（24：1），混匀，离心12000g×5min。

7. 取上层液到一新微量离心管，加等体积异丙醇，混匀，-20℃1hr，4℃离心12000g×10min，去上清液。

8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀室温下晾干。

9. 沉淀溶于20μl TE，-20℃保存备用。

三、注意事项

1. 用于裂解的噬菌体、宿主菌为新鲜培养获得时，裂解好、裂解噬菌体收获量大。

2. 液体培养裂解时，如到培养时间时裂解尚未发生，可适当提高培养温度或加大摇震速度。

3. RNase A 、DnaseI消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌体。

4. /氯仿抽提时，注意PEG、蛋白质等杂质污染，它们会影响限制性内切酶切割。