简易过碘酸钠法具体操作步骤

【资料简介】

简易过碘酸钠法 本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所 获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重 大损失，是目前zui常用的方法。

1. 原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以 避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝 基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成 斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原稳定的酶标记抗体。

2. 标记步骤: (1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。

(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。

(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过一夜。

(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立 即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小 时。

(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。

(6) 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。 其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。

3. 结果判定： 除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。 IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62