质粒小量抽提试剂盒

【资料简介】

质粒小量抽提试剂盒使用说明：
1. 取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约1.5毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过5毫升，对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过10毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。 粒转细胞效果，建议使用
2. 每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀*散开，无可见细菌团块。
确认溶液I中已经添加了RNase A。zui高速度vortex 5-10秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈
均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。
3. 每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌*裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致zui终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶
液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有*散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇
到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致zui终所得质粒的质量下降。
5. zui高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。
离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱，废液收集管，并在纯化柱上做好标记。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。zui高速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。
质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
7. 在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，zui高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
8. zui高速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇*挥发。
注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能*去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
9. 将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。
溶液V 需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液 V 沾在管壁上，一定要震动管子，使液体滑
落到管底，以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或 MiliQ 级纯水替代溶液V，但是水的pH 应不小于6.5。溶液V 加入后
放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。
10. zui高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒，可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。