Feulgen反应原理及Sohiff液的配制

【资料简介】

Feulgen 反应原理及 Sohiff 液的配制

 

    Feulgen 反应是显示DNA的经典而特异的染色方法，由Feulgen(孚尔根)在1924年提出，因而得名。

(一)Feulgen反应原理

    DNA 可在酸性条件下水解，嘌呤―脱氧核糖之间的糖苷键断开，形成醛基(―CHO)，再用  显示醛基的特异性试剂Schiff试剂处理，形成光镜下所见的细胞核内紫红色反应产物。DNA  经处理而水解。除可破坏脱氧核糖与嘌呤碱外，还可水解嘧啶碱。酸水解核酸的程度与  水解时间长短有关，随着水解时间的延长，嘌呤碱基增多，形成的醛基也随之增多，Feulgen反应加强。如果水解时间过长，DNA将*水解，反而使Feulgen反应减弱。DNA水解时间因组织种类和固定液不同而异，需通过预实验找到合适的水解温度和时间。由于Schiff试剂能与醛基结合，故不能用含醛的固定液固定组织，常用Carnoy固定液。Bouin液不适用于Feulgen反应，因为固定液中含较多的酸，可将DNA水解，影响染色反应。

    Schiff试剂是显示醛基的特异试剂，其反应原理是碱性品红(为红紫色)经亚硫酸处理后变为五色Schiff液，Schiff液遇到醛基时，则被还原形成原有的颜色，即红紫色。碱性品红结构中的醌基是碱性品红中具有紫红色的核心结构，经亚硫酸处理后，则醌基两端的双键打开，形成五色品ii-硫酸复合物为Schiff试剂。如果加热使SO₂逸出，则恢复品红原来的颜色而失去对DNA的染色效果，故配好的Schiff试剂应避免SO₂ 逸出。

Feulgen反应原理

（二）Sohiff液的配制

    将lg碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中，使其*溶解，然后冷却到60℃过滤。加入30ml 1N HCl和3g焦亚硫酸钾(K：S：()；)或亚硫酸钠，塞紧瓶塞，置于暗处或外包黑纸24小时。1N HCl与焦亚硫酸盐生成的SO：将溶液中碱性品红脱色成为无色碱性品红(即白亚磺酸)。如溶液尚有浅黄色，可用0．5g活性炭脱色，摇动几分钟后迅速用粗滤纸过滤．滤液应为清亮五色。制成的Schiff试剂应置于棕色瓶中，瓶塞需拧紧并用黑纸包裹，避光保存于4℃，保质期可达半年。若暴露于空气，或加热则使Schiff试剂中的S0₂ 逸出，变性的Schiff试剂则不能使用。除碱性品红外。其他碱性染料也可制成能与醛基反应的类似Schie  反应液，但是。不能达到五色。在染色时可用l％盐酸乙醇洗去不起反应的余色。Schiff试剂在不同的pH条件下可显示不同的物质，如Sehiff试剂在pH 3．0～4．3时，对Feulgen反应效果好，而pH 2．4时，对PAS(糖原)反应效果好。

    注意：Schiff试剂虽无色，但氧化后为紫红色。同时要防止污染环境，用后要回收。