*酰化探针的制备实验

【资料简介】

*酰化探针的制备实验
实验材料    DNA
试剂、试剂盒    DNA聚合酶dNTP2-疏基乙醇*甘油NaClEDTASDS无水乙醇
仪器、耗材    注射器电泳仪离心机培养箱
实验步骤    
1.  混合以下物质于100 μl 反应体积：

（1）10 μl  10×大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ缓冲液

（2）10 μl  0.5 mmol/l 3dNTP混合液

（3）10 μl  0.5 mmol/l *-11-dNTP贮存液

（4）10 μl  0.5 mmol/l 2-ME

（5）2 μg  DNA

（6）20 U  大肠杆菌聚合酶Ⅰ

（7）DNA酶Ⅰ贮存液，用钱用冷水稀释1000倍

（8）加水到100 μl，15℃温育2~2.5 h。

2.  取6 μl 反应液，煮沸3 min 置于冰浴2 min。
 
3.  加样于琼脂糖凝胶，同时带对照分子量标准，在15 V/cm 电压降下电泳。
 
4.  消化的DNA大小介于100~500 bp 之间，接步骤5继续，若大小在500~1 000核苷酸之间（或更大）加入第二份DNA酶Ⅰ继续温育。
 
5.  加入2 μl，0.5 mol/l pH8.0的EDTA和1 μl 10%SDS，68℃加热10 min 终止反应和灭活DNA酶Ⅰ。
 
6.  在1 ml 注射器中准备如Sephadex G-50离心柱，用2 ml 无水乙醇清洗注射器和硅化的玻璃棉。

7.  接着用4ml H2O冲洗，将G-50介质装入注射器至刻度，用100 μl SDS柱缓冲液冼3~4次，上样。

8.  分离*酰化的探针。探针浓度应约为20 ng/μl ，探针可直接使用，也可在-20℃保存数年而不丧失活性。
 
9.  用比色法估计*酰化反应的程度和探针的质量或进行化学发光检测。

随即寡核苷酸引物合成法

实验材料    DNA
试剂、试剂盒    dNTP*klenow酶TEEDTALiCl乙醇
仪器、耗材    离心机培养箱
实验步骤    
1.  在1. 5 ml 离心管中加入500 ng~2 μg 模板DNA，加水至总体积为34 μl。
 
2.  在沸水中变性DNA 5 min 置于冰浴5 min，稍加旋离。

3.  按顺序加入下列溶液：

（1）10 μl  *酰化随即多聚体

（2）5 μl  dNTP/*混合物

（3）1 μl  klenow酶（5U）

（4）37℃温育1 h。
 
4.  加入3 μl 0.5 mol/l EDTA pH8.0以终止反应。加入5 μl 4 mol/l LiCl和150 μl 冰冷的无水乙醇，置于冰浴30 min。

5.  室温高速离心10 min，沉淀用70%乙醇洗涤。
 
6.  DNA用20 μl pH7.5的TE缓冲液重悬。用比色法或化学发光法估价*酰化反应的效果。