引物延伸实验

【资料简介】

实验材料    RNA
试剂、试剂盒    T4多核苷酸激酶dATP醋酸钠乙醇EDTARNaseA*氯仿
仪器、耗材    恒温培养箱NAP-5柱-70°C冰箱低温离心机
实验步骤    
1.  依次加入下列试剂，建立用以标记引物的反应混合液（终体积10 μl）

（1）2.5 μl  H2O

（2）1 μl  10×T4多核苷酸激酶缓冲液

（3）1 μl  0.1 mol/l DTT

（4）1 μl  1 mol/l 亚精胺

（5）1 μl  50~100 ng/μl 挂核苷酸引物

（6）3 μl  10 μCi/μl［γ-32P］ATP

（7）0.5 μl  20~30 U/μl T4多核苷酸激酶

（8）37℃温育1 h。

2.  加入2 μl 0.5 mol/l EDTA和50 μl TE缓冲液终止反应，于65℃温育5 min。

3.  用硅化过的1 000 μl 吸头塞上玻璃棉作成一小离子交换拄，加入20 μl AG 50W-X8树脂和100 μl DE-52树脂，以1 ml TEN缓冲液洗柱。

4.  将步骤2的标记反应物加入柱子，收集流出液重复上柱。
 
5.  用1 ml，TEN100缓冲液洗柱，然后以0.5 ml TEN300洗，弃洗脱液。
 
6.  以0.4 ml TEN600缓冲液洗脱标记寡核苷酸引物，收集流出液，在有合适屏蔽的容器中保存于-20℃备用。

7.  取RNA样品在微量离心管中将下列物质混合（终体积15 μl）：

（1）10 μl  细胞总RNA

（2）1.5 μl 10×杂交液

（3）3.5 μl  放射性标记寡核苷酸

（4）确保微量离心管密封，并将其淹没在65 ℃水洛中90 min，取出在空温中慢慢冷却。

8.  在冰浴的微量离心管中加入以下延伸反应混合液（终体积每个RNA样品30.33 μl）：

（1）0.9 μl  1mol/l Tris·Cl缓冲液，pH8.3

（2）0.9 μl  0.5 mol/l MgCl2 

（3）0.25 μl  1 mol/l DTT

（4）6.75 μl  1 mg/ml *

（5）1.33 μl  5 mmol/l 4dNTP混合液

（6）20 μl  H2O

（7）0.2 μl  25 U/μl AMV反转录酶
 
9.  在含有RNA及寡核苷酸的微量离心管中，加入30 μl 上述延伸反应混合物，42℃温育1 h。
 
10.  在毎个微量离心管中加入105 μl RNA酶反应混合物，于37 ℃育15 min。

11.  加入15 μl 3 mol/l 乙酸钠和150 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提，将上层水相移入一个干净管子中，再加入300 μl 乙醇沉淀DNA，沉淀物以100 μl 70%乙醇洗涤，用吸管吸去微量的乙醇残余，沉淀晾干5~10 min。

12.  用5 μl 终止/加样染料液重溶沉淀，65℃水浴加热5 min，在9%丙烯酰胺/7 mol/l 尿素凝胶中电泳至溴酚蓝到达凝胶的底部。

13.  干燥凝胶并用增感屏放射自显影。