南京信帆科技有限公司：CAMKII激酶活性检测试剂盒说明书

【资料简介】

信帆生物科技有限公司销售销售“细胞CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂盒”，供应，欢迎。CAMKII激酶活性检测试剂盒说明书。

细胞CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

本所细胞CAMKII激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到CAMKII磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析细胞裂解样品中CAMKII活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或*纯化酶样品中CAMKII激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景

Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases；CAMK；EC2.7.11.17）属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一，主要由Ca2+/钙调素复合物调控，在细胞分裂和分化、神经传导介质分泌、转录因子调节、糖原代谢、肌肉收缩、记忆、心功能等方面发挥作用。在大多数组织中表达，尤其在神经组织中高度表达。功能分类为特异型，其代表为肌凝蛋白轻链蛋白激酶（myosin light chain kinase；MLCK）和多功能型，其代表为Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases II；CAMKII）。亚型分类为I型、II型、和IV型。亚体分类为α、β、γ、δ四种。Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶有3个结构域：N端催化域（catalytic）、中央调节域（regulatory，包含自发抑制域——autoinhibitory domain；AID和Ca2+/钙调素结合中心），和C端协同域（association），Ca2+/钙调素复合物激活CAMK后，产生自发性自我磷酸化。Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II主要作用于中枢神经系统，调节细胞内钙离子瞬时变化，诱导长时程增强（potentiation）、突触可塑性（synaptic plasticity）、神经传导介质合成和释放、与记忆和学习功能相关。其磷酸化目标序列为KKALRRQETVDAL。基于底物KKALRRQETVDAL，在ATP的存在下，受到Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II的活性。其反应方式为：

产品内容

本所清理液（Reagent A）   毫升

本所裂解液（Reagent B）   毫升

本所缓冲液（Reagent C）  毫升

本所酶促液（Reagent D）  微升

本所反应液（Reagent E）  微升

本所底物液（Reagent F）   微升

本所阴性液（Reagent G）  微升

产品说明书     1份

保存方式

保存本所清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效6月

用户自备

CAMKII激酶：用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管：用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

（微型）台式离心机：用于样品预处理

100微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤

• 待测样品准备

• 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
• 小心加入xx毫升本所清理液（Reagent A），覆盖生长表面
• 小心抽去清理液
• 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升本所清理液（Reagent A），混匀细胞
• 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
• 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升本所裂解液（Reagent B），充分混匀
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡15秒
• 置于冰槽里孵育30分钟
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用本所 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测定准备

• 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里 
• 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
• 本所缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

• 背景对照测定

• 移取xx微升本所缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升本所阴性液（Reagent G）
• 放进30℃培养箱里静置10分钟
• 加入xx微升本所酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升本所反应液（Reagent E）
• 加入xx微升本所底物液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

• 样品测定

• 移取xx微升本所缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
• 放进30℃培养箱里静置10分钟
• 加入xx微升本所酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升本所反应液（Reagent E）
• 加入xx微升本所底物液（Reagent F）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟

• 计算样品活性

• 酶标仪测定

• 在96孔板上相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升本所缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 分别加入xx微升本所阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
• 在30℃温度下孵育10分钟
• 分别加入xx微升本所酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升本所反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升本所底物液（Reagent F）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
• 活性计算：

七、抑制剂筛选

• 在96孔板上相应标记：背景、*活性和待测抑制剂样品
• 按下表加入试剂，进行样品预处理

内容物	空背景对照	样本背景	*酶活性	待测抑制剂酶活性
本所缓冲液（Reagent C）	xx微升	xx微升	xx微升	xx微升
本所阴性液（Reagent G）	xx微升	xx微升	xx微升	——
待测抑制剂	——	xx微升	――	xx微升
用户自备的纯化酶	——	——	xx微升（1毫单位）	xx微升（1毫单位）
96孔板每孔总量	空背景对照孔 （xx微升）	样本背景孔 （xx微升）	*活性孔 （xx微升）	待测抑制剂样品孔 （xx微升）
轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育15分钟

• 分别加入xx微升本所酶促液（Reagent D）
• 分别加入xx微升本所反应液（Reagent E）
• 分别加入xx微升本所底物液（Reagent F） 
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
• 抑制活性计算：

注意事项

• 本产品为25次操作，包括背景操作
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 样品处理忌用磷酸缓冲溶液 
• 样品须澄清，至关重要 
• 启动反应后3秒内即刻光度测定
• 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
• 光度测定后，比色皿须清洗*
• 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 本所 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1） 
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 可以使用CAMKII抑制剂（KN-93；IC50=370纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
• Ca2+/钙调素依赖型蛋白激酶II活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感

使用

公司秉着“信誉、客户满意、质量”的宗旨为我们的用户提供产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。