IgG的分离与提纯实验

【资料简介】

实验方法原理    
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用zui广。
 
实验材料    动物血清样品
试剂、试剂盒    硫酸铵NH4OHPB液BaCl2溶液纳氏液洗脱液生理盐水
仪器、耗材    透析袋离心机烧杯搅拌棒
实验步骤    
一、材料与试剂配制 
 
1.  动物血清
 
2.  硫酸铵饱和溶液
 
硫酸铵：800 g~850 g
 
H2O ：1 000 ml
 
加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温，然后以28% NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
 
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置后滤过，加热蒸发H2S即可。
 
3.  0.01 mol/L pH7.4 PB液
 
A液：0.10 mol/L NaH2PO4液
 
NaH2PO4·2H2O ：15.60 g
 
加H2O至1 000 ml
 
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
 
Na2HPO4·12H2O： 35.80 g
 
加H2O至1 000 ml
 
取A液19 ml，B液81 ml加水至1 000 ml即可。
 
4.  1%BaCl2溶液
 
5.  纳氏液
 
HgI ：115.00 g
 
KI： 80.00g
 
加H2O至500.00 ml
 
溶化后过滤，然后再加20%NaOH 500.00 ml，混合即可。
 
6、0.50 mol/L的HCl液和0.50 mol/L的NaOH液
 
7、洗脱液
 
0.03 mol/L的NaCl液。
 
8、透析袋（或玻璃纸）
 
二、操作方法 
 
1.  取20 ml血清，加生理盐水20 ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10 ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30 min。
 
2.  3 000 r/min离心20 min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
 
3.  在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30 ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30 min。
 
4.  3 000 r/min离心20 min，弃上清。
 
5.  于沉淀中加20 ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10 ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30 min。
 
6.  3 000 r/min离心20 min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。
 
7.  用10 ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。
 
8.  透析除盐，在常水中透析，再在生理盐水中于4℃透析24 h，中间换液数次。
 
以1%BaCl2检查透析液中的SO4 2-或以纳氏试剂检查NH4 （取3~4 ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4 存在），直至无SO4 2-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。
 
9.  离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。
 
10.  过DEAE－纤维素层析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS（0.03 mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。
 
11.  蛋白质及其定量鉴定。
 
12.  IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。
 
（1）区带电泳
 
玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。
 
（2）琼脂双相双扩散鉴定
 
预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。
 
（3）免疫电泳鉴定
 
孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。
 
（4）圆盘电泳鉴定
 
用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。
 
13.  IgG的浓缩与保存
 
（1）IgG的浓缩
 
（2）IgG的保存
 
一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。