标记亲和素*法（BA-ELISA）实验

【资料简介】

检测未知抗原
实验方法原理    亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，对*有非常高的亲和力（结合常数高达1015M-1）。*很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的*分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。
实验材料    *化抗体
试剂、试剂盒    酶标记的亲和素
实验步骤    
1.  包被抗体：用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml，于4℃（18～24 h）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min（简称洗涤，下同）。
 
2.  加样：加入待检样品（未知抗原）或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔、阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 h，洗涤。
 
3.  加B-Ab：已作适当稀释的*化抗体（B-Ab），每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～60 min。洗涤。
 
4.  加A-HRP：已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素（A-HRP），每孔加0.1 ml，37℃孵育30～45 min。洗涤4次。
 
5.  底物显色：于上述各反应孔中加入临时配制的TMB（或 OPD）底物应用液0.1 ml，于37 ℃孵育10～30 min。再加2mol/L H2SO4 0.05 ml以终止反应。
 
6.  结果判定：目测或在ELISA比色仪上测 OD 值（见ELISA部分）。 
检测未知抗体
实验方法原理    包被抗原：用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1 ml，于4 ℃放置18～24h。用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。
 
加样：加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、阴性和阳性对照孔。37 ℃孵育1 h，洗涤。
 
加B-Ab2：加稀释过的*化抗抗体（抗人或鼠等的IgG），每孔0.1 ml，37 ℃孵育30～60 min，洗涤。余下步骤同测未知抗原的BA-ELISA。