林可霉素（Lincomycin）ELISA试剂盒使用说明书

【资料简介】

林可霉素（Lincomycin）酶联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

1 使用目的：

本试剂盒用于饲料、鱼、虾和肉类组织（如鸡、牛肉和猪肉），鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿样中林可霉素（Lincomycin）残留的定量检测。

2 实验原理

本试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有林可霉素（Lincomycin）偶联抗原，加入林可霉素（Lincomycin）标准品或样品，游离林可霉素（Lincomycin）与微孔条上预包被的林可霉素（Lincomycin）偶联抗原互相竞争抗林可霉素（Lincomycin）抗体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中林可霉素（Lincomycin）含量成反比，通过标准曲线计算样品中林可霉素（Lincomycin）的含量。  

3 试剂盒组成 

3.1 预包被的林可霉素（Lincomycin）偶联抗原的可拆酶标板：1块（12孔×8条）。
3.2 林可霉素（Lincomycin）标准品：6瓶（1ml/瓶），含量分别是：0 ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1 ppb 

3.3抗林可霉素（Lincomycin）抗体酶结合物：1瓶（6ml）。
3.4显色液A：1瓶（6ml）。
3.5显色液B：1瓶（6ml）。
3.6终止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7样本稀释液：1瓶（10×,  6ml），用于样品稀释用。
3.8浓缩洗涤液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9说明书一份。

4 需要而未提供的材料
4.1 设备
4.1.1波长450nm酶标仪。 
4.1.2粉碎机。
4.1.3量筒。
4.1.4振荡器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。
4.1.7微量移液器。
4.2 试剂
4.2.1去离子水或蒸馏水。
4.2.2 甲醇。
5 贮存
5.1 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻
5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存
6 注意事项
6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。
6.2 不要使用过期试剂盒。
6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温（25±2℃），建议至少回温2小时。
6.4 标准品中含有林可霉素（Lincomycin），使用时应特别注意，操作时应带手套。
6.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。
6.6 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。
6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。
6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果
6.9 混合试剂时应避免起泡。
7 工作液准备
7.1 林可霉素（Lincomycin）标准品溶液：0 ppb，0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1 ppb

7.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用

7.3 样本稀释液：用蒸馏水按1:10(1+9)稀释备用
7.3 显色剂：已备用，避免光线直照
7.4 反应终止液：已备用
8 样品处理程序（样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存）
8.1.1 牛奶
脱脂奶：直接分析。
全脂奶：13000g离心15分钟，取上清液检测（避免取到乳脂）
8.1.2 肝脏： （稀释倍数2）
--称取2g已绞碎的样品到试管中。
--加入14ml的乙腈，然后均质（用20000rpm均质几分钟）。
--振荡15分钟，然后2500g离心15分钟。
--取上清液1ml到另一玻璃管中在40-50℃下蒸干（利用氮气吹干仪或者旋转蒸发器）。
--加入250μl去离子水并漩涡混合。
--溶液待测。
8.1.3 鸡蛋： （稀释倍数2）
--取2g样品到试管中，加入6mL乙腈。
--振荡15分钟，然后3000g离心15分钟。
--取上清液1ml到另一玻璃管中蒸干（40-50℃）。
--加入500μl去离子水并漩涡混合。
--溶液待测。
8.1.4 蜂蜜： (稀释倍数2)
---取蜂蜜2g，置于离心管中（约15mL），加入4mL水溶解。
--加入2ml 乙酸乙脂后，振荡均匀。
--然后3000rpm，离心15分钟。
--取上清液0.5ml置于萃取管中于水浴60℃下以氮气吹干。
--加入0.5ml去离子水混合，振荡约10秒钟。
--取100μl 待测。
推荐使用的其它样品的前处理方法：
8.2.1 组织样： （稀释倍数1）
--取3g绞碎样品置入50ml离心管中。
--加入6ml乙酸乙酯均质。
--以3000g离心10分钟。
--取2ml上清液置入10ml塞玻璃管中，于水浴50℃下以氮气吹干。
--于此玻璃管中加入2ml正己烷，振荡混合。
--再加入1ml去离子水，振荡混合约10秒钟，以离心机3,000g离心10分钟。
--利用吸管吸去包含中间乳化层部分的上层液（正己烷层）；
--取50μl待测。
8.2.2 血清血浆： （稀释倍数1）
--移取1ml血清或血浆至试管中，加2ml乙酸乙酯振荡1分钟。
--室温3000g离心10分钟。
--移取1ml上层的乙酸乙酯至另一试管中，用氮气流60 oC水浴中吹干。
--残留物用0.5ml去离子水溶解。
--取100ul 待测。
8.2.3 饲料样品： （稀释倍数4）
--取1g饲料样品(精细粉碎过的，有代表性的)，放入离心管中。
--加4ml乙酸乙酯剧烈混合1分钟（用可旋转振荡摇床）
--室温3000g离心10分钟。
--移取1ml上层的乙酸乙酯至另一试管中，60 oC氮气流下蒸干。 
--用1ml异辛烷/氯仿混合物(2:3混合)溶解干燥的残留物。
--加入1ml去离子水强烈振荡1分钟。
--室温3000g离心10分钟。
--取100μl上层水相待测。
8.2.4 尿液： （快速处理方法）
--尿液不用处理，直接测定。（如果尿液浑浊，一定要过滤或离心）
9 酶免分析步骤
9.1 实验须知
9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温（25±2℃），时间约2小时。回温至室温（25±2℃）后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保证回温充分，否则影响检测的度和准确度。
9.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存
9.1.3 请不要改变分析程序
9.1.4 请使用的微量移液器
9.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序
9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作
9.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样
9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面
9.2 分析步骤
9.2.1 预*行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测
9.2.2 取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3 样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（10×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)
9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml标准品溶液
9.2.5 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液
9.2.6 在各样品孔中加入50μl样品溶液
9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗林可霉素（Lincomycin）抗体酶结合物
9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。 
9.3 37℃温浴30min （温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差）
9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，zui后一次应在吸水纸上拍打以*除去孔中液体。
9.4 反应
9.4.1 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50μl显色液A，再加 50μl显色液B；轻微晃动反应板使之*混匀
9.4.2 37℃温浴10min
9.4.3 每孔中加入50μl终止液，混匀
9.4.4 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。
10 结果计算
10.1定量分析
10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以*个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0μg/L标准溶液的平均吸光度值
10.1.2以林可霉素（Lincomycin）浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为林可霉素（Lincomycin）浓度的对数值，求得反对数即为测定液中林可霉素（Lincomycin）浓度C（ppb）
10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。 
10.2 半定量测定
10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。
10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。

11 特异性
物质 交叉反应

林可霉素              100%
克林霉素              15%

螺旋霉素              < 0.1%
替米考星              < 0.1%

红霉素                < 0.1%
12 试剂盒参数
本试剂盒检测下限为0.05ppb
B0吸光度*值应大于1.0
试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。
用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。
13 标准曲线模式（仅供参考）
试剂盒提供的标准曲线范围为0.1ppb~8.ppb。

14 分析限制
本试剂盒检测为阳性的样品应该用另一种方法如HPLC或GC/MS加以确证。