总RNA分离纯化标准操作规程（SOP）

【资料简介】

主要仪器
研钵，恒温水浴，旋涡振荡器，冷冻台式高速离心机，
超低温冰箱，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

试剂
1．Trizol试剂（购自invitrogen公司）
2．焦碳酸二乙酯(DEPC)
3．氯仿（新开封）
4．异丙醇（新开封）
5．无RNAse灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（250℃ 3小时）装蒸馏水，然后加入0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
6．75%乙醇：用DEPC处理后的水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于4℃冰箱。 

相关器皿的预处理
1．塑料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已经标明RNase-Free的塑料制品，如果没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物质，活性很强，应在通风橱中小心使用。
2）将需要处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通分橱中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒入废液瓶中，用铝箔封住含有已用DEPC水处理过的塑料制品的容器，高温高压蒸汽灭菌至少30 min。
5）在烘箱中用合适的温度烘烤至干燥。置于干净处备用。
2．玻璃和金属制品
先用去离子水将器皿清洗干净，晾干，用铝箔包好，然后至烘箱中250℃烘烤3 小时以上。

操作步骤
*部分 匀浆
A 从组织中提取总RNA、
1）液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按照每50~100mg组织加入1ml Trizol，转入离心管进行下步操作。
2）匀浆：用电动匀浆器充分匀浆1~2min。注意，组织样品体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好。
B 从培养细胞中提取总RNA
1）粘壁培养细胞：不需蛋白酶消化，先将培养基去除，然后直接将Trizol加入到培养瓶中消化、裂解细胞，Trizol体积按10cm2/ml的比例加入。
2）悬浮培养细胞：直接离心收集细胞后用Trizol重悬、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106个动物、植物或酵母细胞，或1×107个细菌细胞。注意，在加入Trizol之前不能用其他缓冲液洗涤细胞，那样会增加mRNA降解的可能性。另外，在裂解酵母或细菌细胞时可以借助匀浆器。
第二部分 相分离
1．匀浆组织加入Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注意：此时可以放入-70℃保存。
2．室温，12000 r/min，离心5 min。取上清于一新管。
3．按照1ml Trizol加入200µl氯仿，用手振荡混匀后室温放置2~3 min。注意：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
4．4℃，12000 r/min，离心15 min。小心吸取上层水相于一新管。注意：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱中，如只提取RNA，则弃下层酚相。
第三部分 RNA沉淀
5．按照1ml Trizol加入异丙醇0.5 ml，混匀，室温放置5~10 min。
6．4℃，12000 r/min，离心15min。弃上清，RNA沉淀管底。注意：RNA沉淀在离心之前是不可见的，常常在离心管的边缘或者底部形成凝胶状小球。
第四部分 RNA洗涤