实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化

【资料简介】

时荧光定量PCR以其、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。但是定量PCR是对性要求很高的实验，不仅要求在实验前有比较完整的实验设计方案，而且实验的条件对实验结果的影响也非常大。这些都是很多老师与学生非常关心的问题，下面分别从这两个方面来对定量PCR实验做一些阐述。 
定量pcr实验步骤（以mRNA为例）： 
1.设计实验方案：例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计 
2.引物和探针的设计和合成 
3.抽提RNA，测定提取的RNA的浓度 
4.反转录PCR 
5.定量PCR 
6.数据分析 
在进行定量PCR实验的过程中，PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素，因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率zui大值1，因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的性及重复性，影响PCR扩增效率主要有以下几个方面：1，扩增子的长度；2，扩增子的GC含量；3，扩增子、引物和探针的二级结构；4，PCR反应各组分的浓度；5，RNA或者cDNA的纯度。 
进行定量PCR实验时，必须设计好引物和探针，除了能获得高的扩增效率外，对PCR扩增的特异性、消除基因组DNA的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。下图就是使用不同的引物和探针对18SRNA进行定量PCR的荧光曲线图（反应条件和模板都相同）。

探针设计的基本原则：
1. 保守：探针要的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。