线粒体复合体Ⅰ试剂盒分光光度法

【资料简介】

线粒体复合体Ⅰ试剂盒分光光度法 25 管/24 样 
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 
测定意义 
复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶，广泛存在于动物、植物、
微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中zui大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从
NADH 传递给CoQ，同时可使O2还原生成 O2.-
，是呼吸电子传递链上产生O2.-
的主要部位。
测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）
生成状态。 
线粒体复合体Ⅰ试剂盒分光光度法 测定原理 
复合体Ⅰ能够催化NADH 脱氢生成 NAD+
， 在 340nm下测定 NADH 的氧化速率计算出该酶
活性的大小。 
需自备的仪器和用品 
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸
馏水。 
试剂的组成和配制 
试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂二：5mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存； 
试剂四：25mL×1 瓶，-20℃保存； 
试剂五：1 mL×1 支，-20℃保存； 
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入2mL蒸馏水，现配现用； 
工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；现配现用； 
样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 
①  准确称取 0.1g组织或收集 500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和 10uL 试剂三，用冰
浴匀浆器或研钵匀浆。 
②  将匀浆 600g，4℃离心5min。 
③  弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 
④  上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选
做） 。 
⑤  步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，
功率 20％或200W，超声 3s，间隔 10秒，重复30 次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。 
测定步骤： 
1、 分光光度计预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 
2、 样本测定 
（1）工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。 
（2）在 1mL石英比色皿中加入 40μL样本、800μL工作液和 60μL试剂六，立即混匀，
记录 340nm处初始吸光值 A1和  2min后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。 
  
复合体Ⅰ活力单位的计算 
线粒体复合体Ⅰ试剂盒分光光度法 （1）按蛋白浓度计算 
单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 
  复合体Ⅰ活力 （nmol/min/mg prot） =[ΔA×V反总÷ （ε×d） ×109
]÷(V样×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr 
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 
（2）  按样本鲜重计算 
单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 
  复合体Ⅰ活力（nmol/min/g  鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(W×  V 样÷V 样总) 
÷T=365×ΔA÷W 
（3）  按细菌或细胞密度计算 
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 
复合体Ⅰ活力(nmol/min/104
 cell)=[ΔA×V反总÷ （ε×d） ×109
]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.73×ΔA 
V反总：反应体系总体积，9×10-4
 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103
 L  / mol  /cm；d：
比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.04 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；
T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。 
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