辅酶 NAD（H） Ⅰ 含量试剂盒

【资料简介】

辅酶 NAD(H) Ⅰ 含量试剂盒说明书 分光光度法 50 管/24 样 
测定意义 
辅酶 NAD(H) Ⅰ 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+
是糖酵解（EMP）和
三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给
氧，在合成 ATP的同时，形成大量的 ROS，同时 NADH 再生为NAD+
。糖、脂、蛋白质三
大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和 NADH/NAD+
比
值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+
比值说明
细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+
比值升高也可抑制糖酵解和
TCA循环。另外，NAD+
降解产物对细胞信号传导、 代谢和基因表达等具有重要的调控作用。  
辅酶 NAD(H) Ⅰ 含量试剂盒测定原理 
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+
和 NADH，NADH通过 PMS的递氢作用，还原
氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD+
可被乙醇脱氢酶还原为
NADH，进一步采用 MTT还原法检测。 
需自备的仪器和用品 
可见分光光度计、台式离心机、移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 
试剂的组成和配制 
酸性提取液：液体 50mL×1瓶，4℃保存； 
碱性提取液：液体 50mL×1瓶，4℃保存； 
试剂一：液体15 mL×1瓶，4℃保存；   
试剂二：液体4 mL×1瓶，4℃保存； 
试剂三： 粉剂×1 瓶， -20 ℃保存， 用时加入4mL蒸馏水， 混匀， 用不完的试剂4℃保存一周； ；  
试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入 4mL蒸馏水，混匀，用不完的试剂 4℃保存一周； ；  
试剂五：液体1.8mL×1 支，4 ℃保存； 
试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存； 
试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。 
NAD+
和NADH的提取 
1  血清（浆）中 NAD+
和 NADH的提取 
NAD
+
的提取：按照血清（浆）体积（mL） ：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建
议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液） ，煮沸 5min（盖紧，以防止水分散失） ；
冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性
提取液使之中和，混匀，10000g 4  ℃离心10min，取上清，置冰上待测。 
NADH 的提取：按照血清（浆）体积（mL） ：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建
议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液） ，煮沸 5min（盖紧，以防止水分散失） ；
冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性
提取液使之中和，混匀，10000g 4  ℃离心10min，取上清，置冰上待测。 
2 组织中 NAD+
和 NADH的提取： 
NAD
+
的提取：按照组织质量（g） ：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10的比例（建议取约 0.1g
组织，加入1mL酸性提取液） ，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失） ；冰浴中冷
却后，10000g 4 ℃离心 10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使
之中和，混匀，10000g 4  ℃离心10min，取上清，置冰上待测。 
NADH 的提取：按照组织质量（g） ：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10的比例（建议取约 0.1g
组织，加入1mL碱性提取液） ，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失） ；冰浴中冷
却后，10000g 4 ℃离心 10min；取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使
之中和，混匀，10000g 4  ℃离心10min，取上清，置冰上待测。 
3  细胞或细菌中 NAD+
和 NADH的提取： 
NAD
+
的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104
个）：酸性
提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细菌或细胞加入 1mL酸性提取液），
超声波破碎 1min（冰浴，强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min（盖紧，以防止
水分散失） ；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取上清液至另一新的离心管中，加入
等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。 
NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104
个）：碱
性提取液体积 （mL） 为 500~1000： 1 的比例 （建议 500万细菌或细胞加入 1mL碱性提取液），
超声波破碎 1min（冰浴，强度 20％或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min（盖紧，以防止
水分散失） ；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取上清液至另一新的离心管中，加入
等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心10min，取上清，置冰上待测。 
测定步骤： 
1、 分光光度计预热 30min以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。 
2、 加样表(在 1.5mL棕色 EP管中按下表依次加样） ： 
试剂名称(μL)  对照管  测定管 
样本  50  50 
试剂一  250  250 
试剂二  75  75 
试剂三  75  75 
试剂四  75  75 
试剂五  35  35 
试剂六  500  混匀，室温避光静置20min 
试剂六    500 
充分混匀，静置 5min后，20000g，常温离心 5min，弃上清，沉淀中加入： 
试剂七  1000  1000 
混匀，570nm下比色，读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值A2，计算△A=A2-A1。 
注意事项 
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。 
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加
试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。 
3、反应过程中注意避光。 
4、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50管保证测 24个 NAD+
或 NADH.。 
NAD+和NADH含量的计算 
（一）NAD+
含量的计算 
1、血清（浆）中 NAD+
含量计算 
NAD+
含量(nmol/mL）=[ (△A -0.099）×36.1×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 722×(△A -0.099） 
2、组织、细菌或细胞中 NAD+
含量计算 
(1)按样本蛋白浓度计算 
NAD+
 (nmol/mg prot）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(V1×Cpr)= 36.1×(△A -0.099）÷Cpr 
(2)按样本鲜重计算 
NAD+
 (nmol/g 鲜重）= [ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(W×V1÷V2)= 72.2×(△A -0.099）÷W 
  (3)按细菌或细胞密度计算 
NAD+
 (nmol/104
 cell）=[ (△A -0.099）×36.1×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.1444×(△A -0.099） 
（二）NADH含量的计算 
1、血清（浆）中 NADH 含量计算 
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 494×(△A -0.065） 
2、组织、细菌或细胞中 NADH含量计算 
(1)按样本蛋白浓度计算 
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(V1×Cpr)= 24.7×(△A -0.065）÷Cpr 
(2)按样本鲜重计算 
NADH (nmol/g 鲜重）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 49.4×(△A -0.065）÷W 
(3)按细菌或细胞密度计算 
NADH (nmol/104
 cell）= [ (△A -0.065）×24.7×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0988×(△A -0.065） 
V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）
体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；  W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，
500 万。 
 辅酶 NAD(H) Ⅰ 含量试剂盒齐一生物以上资料供参考，咨询选购