ELISA方法检测牛分枝杆菌抗体研究及应用

【资料简介】

                      ELISA方法检测牛分枝杆菌抗体研究及应用

    E LI sA 诊断抗原选择结核分枝杆菌特异性抗原M p B s 3、M p B 7 o、e F P l o 和E s A T 一6 是近几年讨论和研究的热点, 被认为是比较有希望的牛结核病特异性诊断候选抗原。
这些抗原用于E U S A 检测结核病的研究还不多。M P B 70 是牛分枝杆菌感染过程中重要的体液和
细胞免疫目标抗原, 可作为牛分枝杆菌感染的诊断试剂1201。但由于M P B 70 是B c G 中的一种重要成分,因此不能区分自然感染和B C G 免疫。已有的报道显示,M P B 70 用于E LI s A 检测牛结核病的特异性可达90 % 以上, 而敏感性却很不稳定7[, “ ,。M P B 83 是牛分枝杆菌表面相关的分泌型脂蛋白, 在牛分枝杆菌中高水平表达, 但在结核分枝杆菌中很少表达l2l]。据报道, M p B 83 能够检测出结核病牛, 并能区分出B c G 免疫牛l2]。M P B 83 检测结核牛血清抗体有较高的特异性, 但敏感性却有争议9l[。sE A 6T 和c F 1P 0 是结核分枝杆菌早期分泌蛋白〔23] ,由于他们只存在于结核分枝杆菌复合群及其它几种致病性分枝杆菌中, 且都在卡介苗中缺失, 因此有望成为鉴别诊断候选抗原。用E S A T一6 检测结核病牛血清抗体敏感性和特异性分别达到了98.6 % 和98.5 % 81[。c FlP o 检测抗体的特异性也很高, 但单独用c F P 10 作为抗原检测结核抗体敏感性很低【’ 01。E s A T 一6 和c F P 10 重组抗原的运用不仅可以提高结核检测的敏感性「川, 而且能用于鉴别卡介苗免疫与临床自然感染工25]。

    E LI s A 方法二十多年前就已经被用于结核病的诊断, 然而多年来一直没有得到推广应用, 主要原因是其特异性、敏感性和稳定性都不十分令人满意。我们选用上述3 种结核菌特异性抗原, 有望提高E lL s A 诊断方法的特异性和敏感性, 为我国牛结核病的临床诊断提供。3.2 E U S A 条件的改进比较已报道的E l S A 检测方法, 本研究摈弃了二抗稀释液中牛血清白蛋白(B S A ) 的使用, 排除了B S A 对E U S A 检测的可能干扰[ ’ 9] , 同时提高了酶标二抗的使用效率, 在不影响检测结果的条件下, 将酶标二抗的稀释倍数从l : 2 0 0 0 0 提高到l : 10 0 0 0 0。3.3 E LI S A 的敏感性和特异性由于结核菌素皮内变态反应( T s )T 是oI E 及我国的牛结核病检疫的推荐方法, 因此, 本研究用T S T 作为标准评价E LI S A 的敏感性。细菌学检查虽是结核病诊断的标准, 但检出率低, 检测条件要求高, 因此, 我们在本试验室开展细菌分离试验, 只是借助武汉市结核病防治院(所) 的条件, 做了小范围的细菌分离鉴定, 以证实E IL s A 检测的准确性。结果表明, 用E LI S A 方法同时检测3 种蛋白的血清抗体, 其与T S T 的阳性符合率或敏感性可达70.4 %。由于抗体阳性与病程成正比, 推测E LI S A 检测强阳性牛可能出现临床或病理症状, 因此, 进一步分菌鉴定, 结果证实了5 头牛为细菌分离阳性。实验室买下了其中一头, 解剖发现了典型的结核病病理变化(资料未显示)。对5 头细菌分离阳性牛进行T S T 检测, 结果3 头阳性, 2 头可疑, 进一步证实, E LI S A 方法的可靠性较高, 检测重度感染牛具有更高的敏感性。同时, 检测结果表明, E LI S A 并不能包含全部的T S T 阳性牛, 而T S T 也不能包含全部的E IL S A阳性牛, 这一点与机体抗结核菌的免疫规律是一致的。早在19 7 7 年,eL nz in 26[] 等就发现了结核病的细胞免疫与体液免疫分离的现象, 并指出细胞免疫在感染早期出现, 随病情加重而减弱, 体液免疫随病情加重而增强。因此, E IL S A 抗体检测有利于检出与淘汰危险性大的严重感染牛。此外, T s T 与E IL s A 结果的差异还可能与T S T 存在严重的非特异性反应[ ’ 〕及因机体免疫力底下而引起的假阳性反应’ 2 , ’ 有关。特异性试验结果表明, 本研究建立的ElL s A 方法与牛的5 种主要病原无血清学交叉反应, 显示出良好的特异性。至于该E LI S A 方法能否鉴别诊断其他分枝杆菌感染及B C G 免疫还有待进一步验证。综上所述, 本研究所建立的间接E LI S A 方法可有效检测几种牛结核病特异蛋白的抗体, 在初步应用中表现了良好的敏感性和特异性。由于抗体阳性与牛结核病的病程呈正相关, 而皮内变态反应与病程呈负相关, 因此检测抗体的间接E u s A 方法与皮内变态反应具有较强的互补性。由于抗体检测省时省力, 易实现自动化与程序化, 在我国及世界上部分发展中国家的牛结核病严重流行地区, 检测抗体的间接E U S A 方法应当具有重要的应用价值