细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书

【资料简介】

细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂是一种旨在通过二甲基-4-亚硝基苯胺，受到单线态
氧气-的作用，出现去色现象，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的生成和增加
的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰
老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基
（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧
自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）
次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等
细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中单线态氧
气（singlet oxygen；1 O2）是分子氧（O2）的抗磁形式或电激发形式。通过染料分子，例如孟加拉红（Rose
Bengal）、亚甲基兰（Methylene Blue）、卟啉类化合物（Porphyrins）染料的光敏过程中能量转移产生，或过
氧化氢和次氯酸的化学反应产生。单线态氧气可以调节紫外线A辐射的生物学作用、激活各种细胞信号通
路等。单线态氧气会导致植物的光动力损伤（photodynamic damage）和动物心血管问题。基于二甲基-4-亚
硝基苯胺（N,N-Dimethyl-p-nitrosoaniline；PNDA或RNO）作为单线态氧气的选择性受体，在单线态氧气的
存在下，产生去色作用，在分光光度仪下（440nm波长），呈现吸光峰值的降低。据此定量检测细胞内单线
态氧气活性氧族的浓度。
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 毫升
阴性液（Reagent E） 毫升
产品说明书1 份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里；反应液（Reagent D）避免光照；有
效保证6 月
用户自备
1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
培养箱：用于反应孵育
比色皿或酶标板：用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1. 准备好25cm2 细胞培养瓶或60mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至5 X 106 细胞）
2. 小心加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5. 加入xx 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6. 移入到预冷的15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7. 放进4℃台式离心机离心5 分钟，速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10. 转移到预冷的1.5 毫升离心管
1． 强力涡旋震荡15 秒
11. 置于冰槽里孵育30 分钟
12. 放进4℃微型台式离心机离心15 分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13. 小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管
14. 移取10 微升进行蛋白定量检测
15. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1． 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长440nm，并置零
2． 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）避免光照
三、背景对照测定
1． 移取xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx 微升阴性液（Reagent E）
3． 加入xx 微升反应液（Reagent D）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在30℃温度下孵育40 分钟
6． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照
四、样品测定
1． 移取xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100 微升待测样品（50 微克蛋白）（注意：样品须清澈）
3． 加入xx 微升反应液（Reagent D）
4． 上下倾倒数次，混匀
5． 在30℃温度下孵育40 分钟
6． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数
五、计算样品浓度
[（样品读数－背景读数）X 1 （体系容量；毫升）X 样品稀释倍数]÷[0.1（样品容量；毫升）X 34.4（毫摩
尔吸光系数）]＝微摩尔1 O2/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔1 O2/毫克
六、酶标板测定
1． 在96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取xx 微升缓冲液（Reagent C）到96 孔板的所有孔中
3． 分别加入xx 微升阴性液（Reagent E）或待测样品（20 微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
4． 分别加入xx 微升反应液（Reagent D）到96 孔板的所有孔中
5． 轻轻摇动96 孔酶标板
6． 在30℃温度下孵育40 分钟
7． 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数
8． 浓度计算：
[（样品读数－背景读数）X 0.25 （体系容量；毫升）X 样品稀释倍数]÷[0.025（样品容量；毫升）X 34.4
（毫摩尔吸光系数）X 0.6（厘米）]＝微摩尔1 O2/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝微摩尔1 O2/毫克
注意事项
1． 本产品为20 次（比色皿）或80 次（酶标板）操作
2． 避免使用*处理样品
3． 操作时，须戴手套
4． 孵育时，避免光照
5． 系统操作过程中，背景测定只需1 次
6． 建议使用比色皿测定
7． 样品须澄清，至关重要
8． 测定值由高到低变化
9． 比色测定后，比色皿须清洗*
10．建议待测样本蛋白浓度为50 微克/100 微升；如果样本浓度过低或过高， 则可以增加或降低样本量
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．可以使用单线态氧气抑制剂或清除剂（scavenger），即NaN3 和DABCO 作为抑制剂对照或阴性对照
13．可以使用单线态氧气激发剂（generator），即萘啶酮酸（Nalidixic acid）等作为阳性对照
14．本公司提供系列活性氧检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感