黄芪甲苷对体外培养内皮细胞影响的实验研究
     血管生成(angiogenesis)在人体正常组织脏器发育以及 疾病的发生发展中发挥着重要的作用。血管生成主要涉及 到内皮细胞的增殖、迁移等过程。正常情况下这些过程受到 严密调控，而相对处于平衡状态；但当机体出现某种疾病时， 这种平衡机制被某些因素所打破，造成血管生成的障碍。近 年来，针对疾病状态下异常的血管新生已经成为国内外研 究的热点。5／6肾切大鼠模型是慢性肾脏病进行性进展的经 典动物模型。在该大鼠模型中，内皮细胞的受损及凋亡表现 突出，尤其在肾切8—12周时，凋亡的内皮细胞数量有一个 加剧的过程。在这个阶段里，如果加用某些药物干预，则 可对内皮细胞的凋亡起到一定的保护作用，并可以延缓慢 性肾脏病的进展。现已有众多研究证明黄芪等中药具有改 善内皮细胞功能，促进内皮细胞修复及再生等药理作用。 本实验研究以中药血清药理学为实验方法，从体外实验的 角度探讨黄芪甲苷对以肾衰模型大鼠血清干预培养而受损 的内皮细胞的影响。


1 材料与方法


1．1 药品及试剂RPMI一1640培养基(美国GIBCO公司)； 胎牛血清(FCS，美国Hycolon公司)；四甲基偶氮唑盐 (MTT，美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO)(天津市福晨 化学试剂厂)；黄芪甲苷标准品并由l％羧甲基纤维素钠溶解配成溶液。


1．2 仪器设备超净工作台(北京半导体设备一厂)；C02 细胞培养箱(日本三洋公司)；倒置显微镜(K70、CKX31日 本OLYMPUS公司)；数码照相机(C7070 Et本OLYMPUS公 司)；酶标仪(美国Bio～Rad公司)；aeeu-jetpro移液枪(德国 Ependof公司)；AL204电子天平(METFLER TOLEDO上海 有限公司)。


1．3 实验动物健康雄性Wistar大鼠30只，体重250～ 320 g，SPF级(中科院上海药物所提供)。


1．4 模型制备及各实验用血清的制备方法正常Wismr 大鼠30只，其中l0只正常血清组：饲养12周后处死采血， 以制备正常大鼠血清；10只肾衰模型血清组：适应性饲养1 周后，以Ormrod和Miller所采用的改良5／6肾切法，进行 5／6肾切除手术，并饲养12周后处死取血，以制备肾衰模型 大鼠血清；10只黄芪甲苷给药正常血清组：正常饲养12周 后，按以下方法以黄芪甲苷标准品配制的溶液进行灌胃，并 制备实验用黄芪甲苷给药正常大鼠含药血清。


1．5 HUVEC内皮细胞系的复苏从液氮中取出冻存HU— VEC细胞，快速解冻；将冻存细胞液L从冻存管中移出)加入 到装有10ml的无血清培养液的小离心管中，轻轻混匀；离 一C~,(12oo rmp，5分钟)；弃上清；加入10ml 10％培养液，反复吹打混匀；接种细胞到培养瓶(5m1)，置于37℃ C02温箱中 培养。


1．6 M ITr法检测各组细胞增殖能力 收集对数期HUVEC细胞，调整细胞悬液浓度，分于96 孔板，调整细胞数为1 x 104／孑L／100ul；置37℃ 、5％C02温 箱以10％FCS的培养液培养，使细胞贴壁24小时；用无血 清培养液同步培养24小时；换上以不同的实验用血清配制 的细胞培养液各200 1／孔，继续培养；共分三组：1)正常血 清组(10％正常大鼠血清+90％1640培养液)；2)肾衰血清 组(5％肾衰模型大鼠血清+5％正常大鼠血清+90％1640 培养液)；3)黄芪甲苷干预肾衰血清组(5％肾衰模型大鼠血 清+5％黄芪甲苷含药大鼠血清+90％1640培养液)。观察 12，24，48小时3个时问点的各组细胞增殖的能力；小心吸 去上清，PBS轻轻洗涤，再次弃上清；每孔加入100ul新鲜 培养液，再加入20ul 5％的MTF溶液，继续培养3 h；终止培 养，小心吸去孔内培养液；每孔加入100ul二甲基亚砜 (DMSO)，置温箱中5rain，使结晶物充分溶解。在酶联免疫 检测仪490nm处测量各孔的吸光值；同时，每个时问点设 置二个调零孑L(培养基、Mr丌、二甲基亚砜)，每实验组没定 6复孔。


1．7 内皮细胞迁移实验(划痕实验)检测细胞迁移能力 取HUVEC细胞按每孔1 x l05／500 I接种于24孔 板；正常培养24小时后弃去培养液，换上只含有0．5％FCS 的培养液，各孔500ul，持续24小时以达到细胞同步化；换 上以不同的实验用血清配制的细胞培养液各500 1／孑L，实 验分组同上；用单位为100“1的移液器滴头在每个孔中沿 培养板底部呈”一”字形划痕，在100倍倒置显微镜下每 孔任意选取3个视野照相以记录划痕区的相对距离；按 500 1／孔加入不同血清配制的培养液，每个组设3个复孔， 继续培养；18小时后，照相并记录加药后划痕区的相对距 离，并计算各组细胞平均迁移距离，并计算其细胞迁移率。


1．8 统计方法以SPSS15．0统计软件行统计分析，使用均 数±标准差(X±S)描述，正常血清组与肾衰血清组之间， 以及肾衰血清组与黄芪甲苷干预’肾衰血清组之间分别以独 立样本资料￡检验(Independent—Sample T Test)统计方法实 现，以P
2 结果


2．1 MTT检测结果


与正常血清组比较，在不同组血清培养12小时以及 24小时时，三组血清的MTT吸光度值无明显差异(P>0． 05)；在继续培养干预到48小时时，肾衰血清组MTT吸光 度较止常血清组显著降低(P<0．01)。与肾衰血清组相比，黄芪甲苷干预肾衰血清组M1Tr吸光度值有所提高(P<0．05)。


2．2 内皮细胞迁移实验(划痕实验)检测细胞迁移能力 与正常血清组比较，肾衰血清组在培养18小时后细胞 的迁移率明显降低(P<0．01)；而黄芪甲苷干预肾衰血清组 的细胞迁移率较肾衰血清组明显升高(P<0．01)。(见表2)


3 讨论


根据中医理论，黄芪是通过益气扶正等机制保护肾脏， 从而延缓。圩功能的进展及其进行性恶化。《素问·通评虚实 论》说：“精气夺则需”。慢性。肾脏病病程缠绵，久病多虚，及 至慢性肾衰，其虚损之程度必然更重，临床可表现为腰酸腰 痛、神疲乏力、面色痿黄或无华等症。因此，治病求本、扶助 正气是治疗该病的主线。黄芪味甘，性微温，归脾、肺经。有 益气扶阳利尿之功，补气之力甚佳，为治疗气虚倦怠的要 药。《本经逢原》日该药“能补五脏诸虚”。


本实验从黄芪的主要有效成分一一黄芪甲苷人手，以中 药血清药理学及体外培养HUVEC细胞为实验方法，提示 该有效成分可以通过改善受损内皮细胞的增殖能力及迁移 能力等途径，在一定程度上起到修复内皮细胞的作用；从而 更进一步地揭示，该药能通过保护血管内皮细胞而达到保 护残存肾单位，而延缓慢性肾脏病的进展。