Rubisco试剂盒说明书

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）试剂盒说明书

分光光度法 25 管/24 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定，同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）试剂盒说明书测定原理：

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与 1 分子的 CO2 结合，产生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的变化可计算还原型辅酶 I 氧化速率，还原型辅酶 I 氧化速率可反应 Rubisco 的活性。
需自备的仪器和用品：

可见-紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：

提取液一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
提取液二：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：25mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 875uL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 875uL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）试剂盒说明书粗酶液制备：

①总 Rubisco 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。②胞浆和叶绿体 Rubisco 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 Rubisco 酶活性。

建议测定总 Rubisco 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco，则按照步骤②提取粗酶液。

测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前在试剂二中加入 22.5mL 试剂一，充分混匀，在 25℃孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；3、测定：在 1mL 石英比色皿中依次加入 30uL 样本、35uL 试剂三、35uL 试剂四和 900uL
工作液，混匀；记录340nm 处20 s 时吸光值A1 和2 min 20 s 时的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
Rubisco 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 n mol NADH。

Rubisco 活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =2680×ΔA÷Cpr

此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。2、按样本鲜重计算
单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco 活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V  反总÷ （ε×d ）×109]÷(V  样÷V  样总×W)

÷T=2680×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义：

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）试剂盒说明书V 反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g。