几种基因分析型的方法

(一)基本原理

    根据HLA核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列，设计一系列等位基因型别特异性顺序引物。引物的3'-端碱基根据多态性序列与其严格互补。因此，每一型别都具有特定的引物对相对应。通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带。如果是纯合子，产生一条与特异性引物相对应的扩增带；如果是杂合子则产生两条与特异性引物对应的扩增带。其特异性可到分辨出一个碱基的差异。扩增产物仅需借助常规的琼脂糖凝胶电泳，即可根据是否存在特异性产物的电泳条带直接进行HLA基因分型。抗原

(二)方法

1．PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)这是首先建立的对多态性进行检测的DNA分析技术。个体间抗原特异性来自氨基酸顺序的差别，后者由编码基因的碱基顺序不同所决定。这种碱基顺序的差别造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同，从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。用特异性探针对整个基因组DNA酶切片段进行杂交，即可分析限制性长度片段多态性。该法不需探针，简单快速，可识别单个碱基不同的序列及2个连锁的位点。

2．PCR一序列特异性寡核苷酸探针(sequence specific oligonucleotide probes，SSOP)此法用人工合成的HLA型别特异的寡核昔酸序列作为探针，与待检细胞经PCR扩增的HLA基因片段杂交，从而确定HLA型别，PCR技术可将HLA复合体上基因片段特异性地扩增5～6个数量级；而专门设计的SSOP又能探测出等位基因间1～2个核苷酸的差异，故PCR／SSOP技术具有灵敏度高、特异性强、需样本量少等优点。

3．PCR等位基因组特异性引物(．sequence specific primer，SSP) 目前常规的HLA—DNA分型技术，包括上述的PCR／RFLP、ECR／SSOP等，zui终均需用标记的特性探针与扩增产物进行杂交，再分析结果。PCR／SSP方法设计出一整套等位基因组特异性引物，借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HIJA型别，从而大大简化了实验步骤。

    由于传统方法在Ⅱ类抗原分型方面困难较大，故上述几种基因分析型方法目前主要用于Ⅱ类基因座。此外，目前已建立的HLA-NN分型技术还包括PCR单链构象多态性分析(PCR—single strand conformational polymorphism，PCR—SSCP)和PCR异源二聚体电泳多态即PCR指纹图(PCR finger printing)分析。