平板克隆形成试验

    细胞克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上时细胞数量已达60个左右，此细胞群体成为克隆或集落，大小在0．3～1．0mm之间。通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖率和对生存环境的适应性。克隆形成率高者其独立生存能力强，例如永生性细胞或癌细胞克隆形成率高，正常细胞则很低。常用的方法有平板克隆形成试验和软琼脂克隆形成试验。

一、材料

1．待测的培养细胞。

2．细胞培养液．0．25％*，PBS溶液，Giemsa染色液。

3．培养皿．吸管，培养板。

4．CO2培养箱，倒置显微镜。

二、方法

1．制备细胞悬液低密度细胞悬液一般根据需要配成]0~100个／ml。取生长良好的对数生长期单层培养细胞，吸出培养瓶内的培养液，用0．25％*消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10％牛血清RPMI 1640培养液中备用。

2．接种和培养用吸管轻轻吹打细胞悬液，使之混悬均匀后，将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种于含10ml 37℃预温培养液的培养皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5％CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2～3周。

3．观察当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心洗2次。加纯甲醇或1：3醋酸／甲醇5ml，固定15min。然后弃掉固定液，加适量Giemsa应用染色液染10~30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

三、结果分析

1.计算各皿克隆数将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。

2．计算克隆形成率计算公式为：

克隆形成率=克隆数／接种细胞数×100%

四、注意事项

1．克隆形成率与接种密度有一定关系，为减少实验误差，细胞悬液中细胞应分散充分，单个细胞比率至少在90％以上。此外，接种密度不能过大。

2．培养期问应根据培养液pH变化适当更换培养液。

3．平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。

4．由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱．肿瘤细胞强。