肠激酶（也称为肠肽酶）是由十二指肠壁细胞产生的siansuan蛋白酶，是人和动物消化系统中的关键酶。肠激酶将yidambaimei原转化为yidanbaimei的活性形式，从而导致胰腺消化酶的后续活化。肠激酶的缺乏会导致肠道消化功能障碍。肠激酶的抑制可能通过抑制与癌变和转移有关的蛋白酶而具有抗肿瘤作用。因此，肠激酶的高选择性和灵敏检测在生化应用中起着关键作用。Amplite™比色肠激酶活性测定试剂盒提供了用于定量肠激酶活性的灵敏测定。

协议摘要

1. 准备测试样品和肠激酶标准液（50 µL）

2. 加入等体积的肠激酶工作溶液（50 µL）

3. 在37°C下孵育30-60分钟

4. 监测405 nm处的吸光度增加

重要说明
开始实验前，在室温下解冻每个试剂盒成分的小瓶。

储备溶液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性使用的等分试样，并在制备后储存在-20°C下。避免重复冻融循环。

1. EK Yellow™储备溶液（100X）：
将50 µL DMSO（组分E）添加到EK Yellow™（组分A）中，制成100X储备溶液。

2.肠激酶底物原液（100X）：
将50 µL DMSO（组分E）添加到肠激酶底物（组分B）中制成100X原液。

3.肠激酶标准溶液（10 µg / mL）：
将50 µL ddH ₂ O + 0.1％BSA加入肠激酶标准小瓶（组分D）中，制成10 µg / mL肠激酶储备液。

配制标准溶液

为了方便起见，请使用我们的系列稀释计

将10 µL的10 µg / mL肠激酶标准溶液加到990 µL的测定缓冲液（组分C）中，得到100 ng / mL的肠激酶溶液（EK7）。然后在测定缓冲液中进行1：2的连续稀释以获得连续稀释的肠激酶标准品（EK6-EK1）。注意： EK标准仅用于阳性对照，不应作为酶活性的定量标准。

准备工作溶液

将50 µL EK Yellow™储备溶液和50 µL肠激酶底物储备溶液加入5 mL的测定缓冲液（组分C）中；充分混合以制成肠激酶（EK）工作溶液（组分A + B + C）。注意：分析混合物足以用于一块96孔板。它不稳定，请及时使用。

程序

表1.在96孔透明底部微孔板中肠激酶标准品和测试样品的布局。EK =肠激酶标准品（EK1-EK7，1.56至100 ng / mL）; BL =空白对照；TS =测试样品。

表2.每个孔的试剂组成。

1. 根据表1和表2提供的布局，将肠激酶标准品（EK），空白对照（BL）和测试样品（TS）准备到96孔透明底部微孔板中。对于384孔板，请使用25 µL每孔试剂，而不是50 µL。
   

2. 将50 µL EK工作溶液添加到肠激酶标准液，空白对照和测试样品的每个孔中，使总测定体积为100 µL /孔。对于384孔板，将25 µL EK工作溶液添加到每个孔中，总体积为50 µL /孔。
   

3. 将反应混合物在37°C下孵育30-60分钟。
   

4. 用吸光度板读数器监测吸光度的增加，并在OD 405 nm处进行路径检查。

数据分析

0.110- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Enterokinase (ng/mL)AbsorbanceHover mouse to interact

从空白标准孔获得的读数（吸光度）用作阴性对照。从其他标准的读数中减去该值即可得到基线校正值。然后，绘制标准读数，以获得标准曲线和方程式。该方程式可用于计算肠激酶样品。