间隙连接蛋白45抗体说明书，CX45抗体价格

注意：当在组织培养板中进行不同剂量的siRNA转染时，转染试剂和siRNA转染培养基的用量需要与不同孔的表面积成比率。

1，准备以下混合物：

（A）加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA转染培养基中，轻柔混合，在室温放置5分钟  注意：如果需要低浓度的siRNA，用siRNA稀释缓冲液稀释

（B） 加1.2ul siRNA转染试剂到20ul siRNA转染培养基中，轻柔混合，室温放置5分钟。注意：虽然，对多种的细胞系有很高的转染效率，但siRAN转染试剂并不是对所有细胞都适合。

2，5分钟后，混合A和B，形成siRNA-siRNA转染试剂复合物，轻柔混合，室温孵育20分钟。

3，孵育后，加160ul siRNA转染培养基到每个含有siRNA-siRNA转染试剂复合物的管中，轻柔混合

  从这一步起，对悬浮细胞和贴壁细胞的处理方法相同

4，转染前，吸弃培养基，用0.3ml无菌siRNA转染培养基洗细胞一次，去除培养基。

5，在洗过的细胞上，铺稀释的siRNA-siRNA转染试剂混合物，37度，5-7小时

6，孵育后，向含有转染细胞的每个孔中加200ul 生长培养基，其中的血清和抗生素浓度是正常浓度的两倍，无需去除转染混合物。如果，毒性是个问题的话，去除转染混合物，以正常生长培养基代替。再孵育18-24小时

7,孵育结束后，用新鲜正常生长培养基替换，继续孵育24-72小时

8,使用恰当的操作步骤检测细胞，参见免疫荧光染色步骤

染色质免疫沉淀间隙连接蛋白45抗体说明书，CX45抗体价格

注意：CHIP的实验步骤可以有很多不同版本，下面介绍的步骤适合大多数的实验

常温下，用PBS洗细胞，重悬细胞，使细胞数大约5*10⁵个/ml（总细胞数2*10⁷）。,

加甲醛，使终浓度为1%，室温孵育10分钟。

加*至终浓度0.125M，终止交联反应

2000rpm,5分钟，离心细胞。用冷的PBS洗细胞一次

用6ml的裂解缓冲液重悬细胞，轻柔混合，2000rpm离心5分钟，收集粗提的核提取物。

再用PBS洗沉淀，沉淀可以冻存，或继续以下步骤。

用1.9ml的高盐裂解缓冲液重悬沉淀，转移到2ml的离心管中准备超声

超声条件需要优化，下面介绍的条件是在使用Sonics VC130和3mm的探头的基础上建立起来的：

在冰上操作，输出功率设置5（R）6,每隔30秒超声一次，共4次。

4°C，10，000rpm 离心15分钟，保存上清，确定上清中蛋白的浓度。

如果免疫沉淀，我们推荐100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz试剂（0.2—2ug）

注意：研究者可能希望使用连接有葡聚糖或磁珠的一抗，以便于选择后续免疫沉淀的试剂。有些情况下，将针对同一种蛋白不同表位的抗体联合使用会更好。

向染色质溶液加50ul Protein A/G-琼脂糖，4度，孵育30分钟，使其澄清，zui大速度，4度离心5分钟。

向上清中加一抗，4度孵育过夜。

加50ul Protein A/G –琼脂糖，4度孵育2小时。

12，000rpm离心20秒收获磁珠，并将管放在冰上

用1ml裂解缓冲液洗磁珠2次

用冲洗缓冲液洗磁珠四次

重悬磁珠在400ul洗脱缓冲液中

通过在67度水浴中孵育管子2小时以上，使反向交叉连接

离心去除磁珠，继续在67度水浴孵育上清过夜 Remove

10,000rpm离心3分钟去除残留的珠子，保留上清

分离DNA,用500ul 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提上清,剧烈振荡，14,000rpm离心3分钟分离两相。

保留水相，用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 （TE）  反向抽提有机相一次，在汇集水相

用600ul 氯仿/异戊醇抽提汇集的水相

DNA可以用商业化的试剂盒浓缩。