1．从新鲜（时间不超过1周）的2YT／tet平板上挑取单个大肠杆菌SS320的克隆，接种到lml 2 YT／tet培养基中。37℃200r／min孵育6～8小时。转移培养基到含有50m1 2YT／tet培养基的500ml带塞锥形瓶中。37℃200r／min培养过夜。
2．将5m1过夜培养基接种于分别含有900m1超级肉汤／tet培养基的6个2L带塞锥形瓶中。37℃200r／min培养细胞至OD600＝0。6-0．8（3-4小时）。
3．冰上冷却3个锥形瓶5分钟，间歇涡旋混匀。
注意：下面的步骤应该在4℃冷室，冰上完成，并且使用预冷的试剂和仪器。
4．用GS3转子（5000g）4℃55000r／rain离心细胞5分钟，使用可以迅速降速的离心机（例如Sorvall RC5B Plus），弃去上清。将剩下3个锥形瓶中的培养基（当*组正在离心时，它们应该处于冷却环境下）加入到相同的管子中，重复离心并弃去上清。
5．用pH 7．4，1．0mmol／L的Hepes装满每个离心管。加入一个无菌的磁性转子到每管中以促进沉淀重悬。简短地涡旋振荡冲下管壁上的沉淀并以一个温和的速度搅拌至沉淀*重悬。
6．用GS3转子4℃55000r／min离心10分钟，弃去上清。在倾倒过程中，将搅拌棒留在离心管中，使其留在与沉淀相反的一面。 当从转子中取出离心管时， 小心维持离心管的角度以免搅乱沉淀。
7．用同样体积的1．Omm01／L的Hepes（如第5步）重悬细胞。用GS3转子4℃S5000r／min离心10分钟，弃去上清。用150mll0％超纯甘油重悬每个沉淀。不要把沉淀混在一起。
8．用GS3转子4℃55000r／min离心细胞15分钟。弃去上清并拿走搅拌棒。用移液器去掉剩余的少量上清。每管加入3．Oml 10％超纯甘油并用移液器重悬沉淀。转移悬浮液到另外一管并重复操作，使所有沉淀都重悬浮。
9．将350ul的一份分装于1．5m1微型离心管中的液体快速冰冻。这个实验方案能制备约12m1浓度为3×1011cfu／ml的细胞。